Polipéptido variante o fragmento del mismo con actividad de xilanasa,

que comprende una mutación seleccionada de entre D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o en posición o posiciones equivalente(s) en otras xilanasas de la familia 11, de tal modo que el polipéptido variante o un fragmento del mismo presenta una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a enzimas mutantes de xilanasa que presentan una sensibilidad alterada a los inhibidores de xilanasa. La presente invención se refiere además a la utilización de estas enzimas mutantes en el tratamiento de materiales vegetales. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Durante muchos años, las endo-β-1,4-xilanasas (EC 3.2.1.8) (denominadas en la presente memoria xilanasas) se han utilizado para la modificación de carbohidratos complejos procedentes del material de la pared de células vegetales. Es bien conocido en la técnica que la funcionalidad de diferentes xilanasas (procedentes de diferentes microorganismos o plantas) se diferencia enormemente. 10

Se han realizado estudios exhaustivos que caracterizan la funcionalidad de la xilanasa en sustratos bien caracterizados y puros (Kormelink et al., 1992). Estos estudios demuestran que diferentes xilanasas tienen diferentes requisitos específicos con respecto a la sustitución de los ejes centrales de xilosa del arabinoxilano (AX). Algunos xilanos requieren tres restos de xilosa insustuidos para hidrolizar el eje central de la xilosa; otros necesitan solamente uno o dos. Se cree que las razones de estas diferencias de especificidad 15 son debidas a la estructura tridimensional en los dominios catalíticos, que a su vez depende la estructura primaria de la xilanasa, es decir la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, la traducción de estas diferencias en las secuencias de aminoácidos en diferencias en la funcionalidad de las xilanasas, no se ha documentado hasta ahora cuando la xilanasa actúa en un medio complejo, tal como un material vegetal.

Los sustratos de xilanasa encontrados en el trigo (harina de trigo), se han dividido tradicionalmente 20 en dos fracciones: la AX (WU-AX) inextraíble en agua y la AX (WE-AX) extraíble en agua. La relación WU-AX:WE-AX es aproximadamente 70:30 en la harina de trigo. Han existido numerosas explicaciones en cuanto a porqué existen dos fracciones diferentes de AX. La bibliografía más antigua (D'Appolonia y MacArthur (1976) y Montgomery y Smith (1955)) describe grandes diferencias en el grado de sustitución entre WU-AX y WE-AX. El mayor grado de sustitución se encontró en WE-AX. Esto se utilizó para explicar porqué alguna de 25 las AX era extraíble. El alto grado de sustitución hizo al polímero soluble, en comparación con un grado de sustitución menor, que produciría el enlace de hidrógeno entre polímeros y por consiguiente precipitación.

La diferencia entre la funcionalidad de diferentes xilanasas se ha creído que es debida a diferencias en la especificidad de la xilanasa y de este modo a su preferencia por los sustratos WU-AX o WE-AX.

En algunas aplicaciones (por ejemplo, en panadería) es deseable producir polímeros solubles de alto 30 peso molecular (HMW) a partir de la fracción WU-AX. Dichos polímeros se han correlacionado con un aumento de volumen en la elaboración de pan (Rouau, 1993; Rouau et al., 1994 y Courtin et al., 1999).

En otras aplicaciones es deseable modificar la WU-AX de HMW, disminuyendo el peso molecular, reduciendo su efecto hidrocoloide y por consiguiente el enlace con el agua en el producto (galletas saladas, separación de harina, etc.). 35

Estas aplicaciones diferentes requieren diferentes funcionalidades de las xilanasas utilizadas para realizar el trabajo. Como se mencionó anteriormente, la diferencia en funcionalidad se ha explicado mediante las diferentes especificidades de sustrato de las xilanasas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En comparación con los estudios iniciales, ahora se ha demostrado que otros factores son más 40 importantes para determinar la funcionalidad de la xilanasa que la especificidad del sustrato de las xilanasas determinada en sustratos puros bien caracterizados. Los datos presentados en la presente memoria demuestran que los inhibidores de xilanasa endógena fijan la funcionalidad de las xilanasas actualmente utilizadas, por ejemplo, sistemas de harina de trigo, Esto significa que una xilanasa que normalmente modifica el WU-AX, proporcionando un aumento de viscosidad líquida de la masa en un sistema de harina de trigo, 45 tiene una funcionalidad diferente si el inhibidor endógeno de la xilanasa está ausente en la harina de trigo. Por lo tanto, los descubrimientos indican que el diseño y la aplicación de las xilanasas no inhibidas, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida podría ser una manera de imitar la ausencia de inhibidores de xilanasa en varios materiales vegetales, proporcionando nuevas xilanasas con funcionalidad completamente nueva. Dichas xilanasas serían muy eficaces en aplicaciones en las que se requiere una reducción de viscosidad. La 50 xilanasa no inhibida actuaría rápidamente en la AX, e influiría principalmente en su actividad específica, en lugar de mediante inhibidores endógenos. A partir de estos estudios, se considera que los efectos inhibidores son probablemente con mucho mas importantes que la actividad específica. De hecho, los resultados demuestran por primera vez que existen 10 a 50 veces diferencias en los niveles de inhibición entre las xilanasas de la familia 11. 55

Además, se ha seguido adelante para diseñar y probar una serie de xilanasas modificadas por mutagénesis dirigida para demostrar que pueden producirse xilanasas que tengan sensibilidad reducida a los inhibidores de xilanasa presentes en los materiales vegetales. En particular, se han identificado numerosos restos en xilanasas de la familia 11 que influyen en el grado de inhibición de la xilanasa.

Por lo tanto, será posible producir variantes de xilanasas con sensibilidad reducida a los inhibidores 5 de xilanasa y por consiguiente con funcionalidad alterada. Esto, por ejemplo, permitirá una reducción en la cantidad de xilanasa requerida en numerosas aplicaciones tal como piensos para animales, producción de almidón, panadería, separación de harina (molienda en húmedo) y producción de papel y pulpa.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un polipéptido de xilanasa variante o un fragmento del mismo que tiene actividad de xilanasa, que comprende una mutación seleccionada de entre 10 D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o en posición o posiciones equivalentes en otras xilanasas de la familia 11 de modo que el polipéptido variante o un fragmento del mismo tiene sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1. 15

Una “enzima original”, es la enzima xilanasa de la que procede o puede proceder la enzima de xilanasa variante. Con respecto a la expresión “que puede proceder”, la variante no necesita necesariamente proceder de la enzima original. En su lugar, la variante podría prepararse, por ejemplo, por utilización de técnicas de ADN recombinante que utilizan secuencia(s) nucleotídica(s) que codifica(n) dicha secuencia de xilanasa variante, es decir aquí la(s) secuencia(s) nucleotídica(s) es o son similares(es) a la(s) secuencia(s) 20 nucleotídica(s) mutada(s) pero no se preparan por mutación de la(s) secuencia(s) nucleotídica(s) original(es). La variante puede prepararse incluso modificando químicamente una enzima original.

La enzima original puede ser la enzima natural. El término “natural” es un término de la materia comprendido por los expertos e incluye un fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una especie natural y que contrasta con el fenotipo de un mutante. De este modo, en el presente contexto, la 25 enzima natural puede ser una forma de la enzima hallada en la naturaleza en la mayoría de los miembros de las especies relevantes. Generalmente, la enzima natural relevante en relación con los polipéptidos de la variante de la invención es la más íntimamente relacionada que corresponde con la enzima natural desde el punto de vista de la homología de secuencia. Por ejemplo, para las xilanasas mutantes específicas descritas en los ejemplos, la correspondiente enzima natural es la xilanasa A natural de B. subtilis, más 30 específicamente la xilanasa A natural de B. subtilis, publicada por Paice et al., 1986 y presentada como SEC. ID. nº 1. Sin embargo, cuando se ha utilizado una secuencia natural específica como base para producir u polipéptido variante de la invención, será la correspondiente secuencia natural independientemente de la existencia...

1. Polipéptido variante o fragmento del mismo con actividad de xilanasa, que comprende una mutación seleccionada de entre D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o en posición o posiciones equivalente(s) en otras 5 xilanasas de la familia 11, de tal modo que el polipéptido variante o un fragmento del mismo presenta una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1.

2. Polipéptido variante o fragmento del mismo según la reivindicación 1, que comprende la 10 mutación D11F.

3. Polipéptido variante o fragmento del mismo según la reivindicación 1 ó 2, que comprende la mutación D11F/R122D.

15

4. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho inhibidor es un inhibidor que se encuentra en la naturaleza en los tejidos vegetales.

5. Composición que comprende un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 20

6. Procedimiento degradación o modificación de una pared de célula vegetal, cuyo procedimiento comprende poner en contacto dicha célula vegetal con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición según la reivindicación 5.

25

7. Procedimiento de tratamiento de un material vegetal, cuyo procedimiento comprende poner en contacto dicho material vegetal con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición según la reivindicación 5.

8. Secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido variante según cualquiera de las 30 reivindicaciones 1 a 4.

9. Montaje que comprende la secuencia nucleotídica de la reivindicación 8.

10. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un 35 procedimiento de modificación de materiales vegetales.

11. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en uno o más de entre: panadería, piensos para animales, producción de almidón, separación de harina (molienda en húmedo) y producción de papel y pulpa. 40

12. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en uno o más de entre: tratamiento de cereales, producción de almidón, piensos para animales, en el tratamiento de la madera, en la mejora del procedimiento de blanqueo de la pulpa de la madera.