Uso de compuestos derivados de bis-benzamidinios como agentes fluorogénicos para señalizar secuencias específicas de ADN de doble cadena.

La presente invención se refiere al uso de un grupo de compuestos derivados de la propamidinapentamidina, que poseen grupos 4-aminobenzamidinios en su estructura, como agentes fluorogénicos de reconocimiento de secuencias de ADN debido a su capacidad para unirse al surco menor del ADN

Uso de compuestos derivados de bis-benzamidinios como agentes fluorogénicos para señalizar secuencias específicas de ADN de doble cadena.

La presente invención se refiere al uso de un grupo de compuestos derivados de la propamidinapentamidina como agentes fluorogénicos de reconocimiento de secuencias de ADN.

Estado de la técnica anterior

Un importante objetivo de las investigaciones actuales en la frontera entre la química y la biología es el desarrollo de agentes químicos capaces de interaccionar de forma eficiente con secuencias específicas de ADN de doble cadena. A lo largo de las últimas décadas se han descrito un gran número de agentes heterocíclicos capaces de unirse selectivamente al ADN insertándose en su surco menor (cfr. Lown, J.W. Pharmacol. Ther. 1999, 84, 1-111). Entre estas moléculas, probablemente las más estudiadas sean aquellas basadas en poliamidas de pirrol e imidazol en estructura de horquilla β, puesto que muestran unas propiedades excelentes en cuanto a afinidad y especificidad de secuencia. Desafortunadamente la síntesis de estos compuestos no es precisamente trivial, y su utilidad in vivo está en gran medida limitada debido a dificultades intrínsecas para atravesar membranas biológicas y notable toxicidad.

Otro tipo de agentes que también reconocen el surco menor del ADN son los compuestos de tipo bis-benzamidiniobencilamidinio, tales como la pentamidina o propamidina. Estas moléculas son especialmente atractivas desde el punto de vista farmacológico, puesto que son estables y presentan buenas propiedades de transporte en numerosas líneas celulares. Así por ejemplo, la pentamidina esta siendo utilizada desde hace años contra la tripanosomiasis, la lesmaniasis y neumonía de P. Carinii. De entre los derivados de bis-amidinas son también especialmente importantes aquellos con conectores de tipo aromático, de hecho la DB289, una prodroga de la furamidina, se encuentra en fase clínica III contra la enfermedad del sueño, y es muy activa contra otros parásitos (cfr. Mathis, A.M., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51, 2801-2810).

Estas propiedades, junto con su simplicidad estructural, han animado la búsqueda de nuevos análogos con propiedades de reconocimiento mejoradas y toxicidades reducidas. En estos momentos, las mayores limitaciones para el desarrollo de este tipo de benzamidinios tienen que ver con la escasa versatilidad y practicidad de las rutas sintéticas existentes y con el hecho de que no exista un método simple, rápido y fiable que permita evaluar y cuantificar su afinidad y selectividad por secuencias específicas del ADN. El método habitual para estudiar la afinidad de este tipo de moléculas se basa en la desnaturalización térmica de sus complejos con el ADN. Sin embargo, este método sólo da información indirecta y bastante cualitativa de las características de reconocimiento de estos compuestos, y además es difícil de implementar en estrategias de high-throughput screening (cfr. Dardonville, C. et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 3748-3752).

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención han observado que sustituyendo las unidades de bis-4-fenoxiamidinio, características de los derivados clásicos de tipo benzamidínico, por 4-aminobenzamidinios se obtienen análogos que poseen una estructura adecuada para interaccionar con secuencias de ADN ricas en A/T, con la ventaja adicional de que exhiben fluorescencia cuando interaccionan con dicho ADN de doble cadena.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de compuesto de fórmula general (I)

donde X se selecciona entre arilo, heteroarilo o alquilo C₁-C₁₀

como agente fluorogénico de reconocimiento de secuencias de ADN.

En la presente invención, el término "agente fluorogénico" se refiere a una molécula fluorescente que posee un grupo funcional que absorbe energía de una longitud de onda específica y la emite en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir, con menor energía), y en el que la cantidad de energía emitida (rendimiento cuántico) depende tanto del propio grupo funcional fluorescente como de su ambiente químico. En concreto, para el caso de las bis-benzamidinas objeto de la presente invención, se produce un aumento significativo (más de 60 veces) en la intensidad de emisión de fluorescencia en presencia de ADN de doble cadena con contiene determinadas secuencias.

El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente entre 1 y 5 átomos de carbono. Por ejemplo, pero sin limitarse a, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo etc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como amina, halógeno, hidroxilo o ácido carboxílico.

El término "arilo" se refiere, en la presente invención, a anillos aromáticos sencillos o múltiples, que tienen de entre 5 a 18 carbonos. Los grupos arilo son por ejemplo, pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono y más preferiblemente el grupo arilo es un fenilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo (C₁-C₆), halógeno, hidroxilo o ácido carboxílico.

El término "heteroarilo" se refiere, en la presente invención a un arilo como definido anteriormente que contiene al menos un heteroátomo tales como nitrógeno, oxígeno o azufre. Preferiblemente nitrógeno.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso del compuesto descrito anteriormente, donde X es un alquilo C₁-C₅. En una realización más preferida, X es CH₂-CH₂-CH₂-. En otra realización más preferida, X es -CH₂-.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso del compuesto según descrito anteriormente, donde X es unfenilo en el que los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición meta o para.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al uso del compuesto según descrito anteriormente, donde X es una piridina en la que los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición meta o para. Más preferiblemente, los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición meta.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere al uso de un compuesto según descrito anteriormente, en el que la secuencia de ADN que se reconoce está formada por 4, 5 ó 6 pares de bases A/T o G/C. Preferiblemente, la secuencia de ADN que se reconoce está formada por 6 pares de bases A/T.

En una realización preferida, la presente invención se refiere al uso del compuesto según descrito anteriormente para ensayos de identificación de agentes de reconocimiento del surco menor del ADN por desplazamiento de la fluorescencia.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras

Fig. 1.- Muestra los espectros de fluorescencia de BAPPA en diferentes disolventes. La concentración de BAPPA es la misma en todos los casos, pero las propiedades fluorogénicas dan como resultado espectros de emisión diferentes.

Fig. 2.- Muestra las valoraciones de BAPPA (0.55 μM in Tris buffer 20 mM pH 7.5, 100 mM NaCl, pH 7.5) con secuencias de ADN seleccionadas. AATTT (medbullet); AATT (medcirc); AAAA (♦);(-); AATG (◊enge)(boxempty) y GGCC (-); ATG (-); AAG (boxempty). Las curvas de unión representan el mejor ajusta con un modelo de interacción 1:1 y teniendo en cuenta la contribución del oligonucleótido a la fluorescencia.

Fig... [Seguir leyendo]

1. Uso del compuesto de fórmula (I)

donde X se selecciona entre arilo, heteroarilo o alquilo C₁-C₁₀ sustituido o no sustituido,

como agente fluorogénico de reconocimiento de secuencias de ADN.

2. Uso del compuesto según la reivindicación 1, donde X es alquilo C₁-C₅.

3. Uso del compuesto según la reivindicación 2, donde X es -CH₂-CH₂-CH₂.

4. Uso del compuesto según la reivindicación 2, donde X es -CH₂-.

5. Uso del compuesto según la reivindicación 1, donde X es un fenilo en el que los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición meta o para.

6. Uso del compuesto según la reivindicación 1, donde X es una piridina en la que los grupos4-aminobenzamidinio se encuentran en posición meta o para.

7. Uso del compuesto según la reivindicación 6, donde X es una piridina en la que los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición meta.

8. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia de ADN que se reconoce está formada por 4, 5 ó 6 pares de bases A/T ó G/C.

9. Uso del compuesto según la reivindicación 8, en el que la secuencia de ADN que se reconoce está formada por 6 pares de bases A/T.

10. Uso del compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para ensayos de identificación de agentes de reconocimiento del surco menor del ADN.