COMPUESTOS DERIVADOS DE BIS-BENZAMIDINIOS COMO AGENTES FLUOROGÉNICOS PARA SEÑALIZAR SECUENCIAS ESPECÍFICAS DE ADN DE DOBLE CADENA.

Compuestos derivados de bis-benzamidinios como agentes fluorogénicos para señalizar secuencias específicas de ADN de doble cadena.

La presente invención se refiere a un grupo de compuestos de estructura benzamidinica, a su procedimiento de síntesis y a su uso como agentes f1uorogénicos de reconocimiento de secuencias de ADN.

Compuestos derivados de bis-benzamidinios como agentes fluorogénicos para señalizar secuencias específicas de ADN de doble cadena.

La presente invención se refiere a un grupo de compuestos derivados de bis-benzamidinios como agentes fluorogénicos de reconocimiento de secuencias de ADN.

Estado de la técnica anterior Un objetivo importante de las investigaciones actuales en la frontera entre la química y la biología es el desarrollo de agentes químicos capaces de interaccionar de forma eficiente con secuencias específicas de ADN de doble cadena. A lo largo de las últimas décadas se han descrito un gran número de agentes heterocíclicos capaces de unirse selectivamente al ADN insertándose en su surco menor (cfr. Lown, J.W. Pharmacol. Ther. 1999, 84, 1-111) . Entre estas moléculas, probablemente las más estudiadas sean aquellas basadas en poliamidas de pirrol e imidazol en estructura de horquilla, puesto que muestran unas propiedades excelentes en cuanto a afinidad y especificidad de secuencia. Desafortunadamente, la síntesis de estos compuestos es laboriosa, y su utilidad in vivo está en gran medida limitada debido a sus dificultades intrínsecas para atravesar membranas biológicas, así como a su notable toxicidad.

Otro tipo de agentes que también reconocen el surco menor del ADN son los compuestos de tipo bis-benzamidinio, tales como la pentamidina (1a) o propamidina (1b) . Estas moléculas son especialmente atractivas desde el punto de vista farmacológico, puesto que son estables y presentan buenas propiedades de transporte en numerosas líneas celulares. Así por ejemplo, la pentamidina esta siendo utilizada desde hace años contra la tripanosomiasis, la lesmaniasis y neumonía de P. Carinii. De entre los derivados de bis-amidinas, son también especialmente importantes aquellos con conectores de tipo aromático; de hecho la DB289, una prodroga de la furamidina (3) , se encuentra en fase clínica III contra la enfermedad del sueño, y es muy activa contra otros parásitos (cfr. Mathis, A.M., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51, 2801-2810) .

Estas propiedades, junto con su simplicidad estructural, han animado la búsqueda de nuevos análogos con propiedades de reconocimiento mejoradas y toxicidades reducidas. En estos momentos, las mayores limitaciones para el desarrollo de este tipo de benzamidinios tienen que ver con la escasa versatilidad y practicidad de las rutas sintéticas existentes y con el hecho de que no exista un método simple, rápido y fiable que permita evaluar y cuantificar su afinidad y selectividad por secuencias específicas del ADN. El método habitual para estudiar la afinidad de este tipo de moléculas se basa en la desnaturalización térmica de sus complejos con el ADN. Sin embargo, este método sólo da información indirecta y cualitativa de las características de reconocimiento de estos compuestos y además es difícil de implementar en estrategias de high-throughput screening (cfr. Dardonville, C. et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 37483752) .

La configuración dador/aceptor en las unidades de 4-carbamidoilfenoxi características de la estructura de propamidina podrían dar lugar a propiedades fluorogénicas y de emisión inducida cuando se insertan en el surco menor del ADN, como consecuencia del cambio ambiental y de polaridad que tienen lugar al insertarse estas moléculas en el surco menor del ADN; sin embargo, la longitud de onda de excitación de la estructura de propamidina coincide con la banda de absorción típica de ADN a 260 nm. Esta coincidencia impide la aplicación de técnicas de fluorescencia para el estudio de su interacción con el ADN.

Los autores de la presente invención han observado que sustituyendo las unidades de 4-fenoxiamidinio, características de los derivados clásicos de tipo benzamidínico, por 4-aminobenzamidinios se obtienen análogos que, además de interaccionar de forma selectiva con secuencias de ADN, presentan la ventaja adicional de que presentan un espectro de absorción desplazado hacia el rojo, que permite la excitación a una longitud de onda más larga (329 nm) y además experimentan un aumento significativo de su intensidad de emisión de fluorescencia a 387 nm cuando se unen a secuencias ricas en A/T pertenecientes a ADN de doble cadena, (O. Vázquez et al., Org. Lett., 2010, 12, 216-219) .

Descripción breve de la invención En la presente invención se describen nuevos derivados del tipo bis-4-aminobenzamidínico que incorporan en su estructura un fluoróforo aceptor. Estos compuestos presentan elevada afinidad por secuencias específicas de ADN de doble cadena, y además señalizan esta interacción emitiendo fluorescencia.

La ventaja adicional de estos compuestos es que al estar presente en su estructura un fluoróforo aceptor emiten luz a una longitud de onda todavía más alta que en los compuestos en los que no están presentes estos grupos, debido a un proceso de transferencia de energía intramolecular desde el sistema de bis-4-aminobenzamidínico hasta el grupo fluoróforo aceptor. Gracias a este proceso de transferencia se extiende de forma efectiva el rango de longitudes de onda de emisión a las cuales se puede monitorizar la presencia de ADN. En un caso particular se incrementó el desplazamiento de Stokes en 145 nm, en lugar de en 60 nm como en los casos en los que no existe este grupo fluoróforo aceptor. Y además, modificando el grupo fluoróforo aceptor es posible diseñar derivados que emitan luz a diferentes longitudes de onda que sean de interés para su aplicación como biosensores luminiscentes.

Otra ventaja adicional es que la intensidad de la banda de emisión se puede incrementar hasta 60 veces, lo que permite detectar cantidades de ADN del orden de nanogramos.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I)

donde Z es un grupo fluoróforo aceptor y n tiene un valor de1a5.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula general (I) que comprende una reacción entre un compuesto de fórmula II y un fluoróforo aceptor, donde Y se selecciona entre hidrógeno y un agente quelante, y n tiene un valor de1a5.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (I) como agente fluorogénico de reconocimiento de secuencias de ADN.

Descripción detallada de la invención En la presente invención, el término "agente fluorogénico" se refiere a una molécula fluorescente que posee un grupo funcional que absorbe energía de una longitud de onda específica y la emite en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir, con menor energía) , y en el que la cantidad de energía emitida (rendimiento cuántico) depende tanto del propio grupo funcional fluorescente como de su ambiente químico.

El término "fluoróforo aceptor" se refiere, en la presente invención, a una especie que participa en un proceso de transmisión de energía de resonancia (FRET) aceptando la energía transferida por otra especie que se encuentra en estado excitado (esta transferencia puede tener lugar a través de cualquier proceso fotofísico, incluyendo mecanismos de tipo Förster o Dexter) . Un parámetro clave para la transferencia de energía entre dos fluoróforos es la combinación de especies con niveles de energía próximos. Esta proximidad se relaciona con la teoría de transferencia de manera que cuanto mayor sea el valor de la integral de solapamiento entre el dador y aceptor (JDA) , entre el espectro de emisión del dador y el espectro de absorción del aceptor, mejor será el FRET. En la presente invención, se incorpora la teoría de transferencia de energía, así como el cálculo de dicha integral, la interpretación de sus valores y la detección de energía de transferencia por medio del siguiente artículo: "Resonante Energy Transfer: Methods and Applications", Analytical Biochemistr y , 1994, 218, 1-13. Además, estos requerimientos energéticos pueden ser visualizados fácilmente por el solapamiento del espectro de emisión del fluoróforo dador y el espectro de excitación del fluoróforo aceptor. En un caso particular de la presente invención se estudió este solapamiento (figura 4) entre espectro de emisión del aminobenzamidinio derivado N1, N3-bis (4-aminodinofenil) propano-1, 3-diamina y el espectro de absorción del compuesto 6, comprobándose que esta combinación de especies es adecuada para llevar a cabo la invención.

El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula general (I)

donde Z es un grupo fluoróforo aceptor y n tiene un valor de1a5.

2. Un compuesto de fórmula general (I) según la reivindicación 1, donde Z se selecciona entre un ión lantánido complejado con un agente quelante o una cumarina de fórmula general III, R3 se selecciona entre hidrógeno, halógeno y alquilo.

3. Un compuesto de fórmula general (I) según la reivindicación 1 y 2, donde el ión lantánido se selecciona entre Eu+3, Tb+3.

4. Un compuesto de fórmula general (I) según la reivindicación1y2, donde el agente quelante se selecciona entre el ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclodecano-l, 4, 7, 10-tetraacético (DOTA) , el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) , 4, 7, 10-Tetraazaciclododecane-1.4.7.10-tetra (ácido metilen fosfónico) (DOTP) , ácido 1, 4, 8, 11-tetraazaciclododecano1.4.8.11-tetraacético (TETA) .

5. Un compuesto de fórmula general (I) según las reivindicaciones anteriores, donde n es 3.

6. Un procedimiento de preparación de un compuesto de fórmula general (I) que comprende una reacción entre un compuesto de fórmula II y una especie fluoróforo aceptor, donde Y es hidrógeno o un agente quelante, y n tiene un valor de1a5.

7. Uso de un compuesto de fórmula general (I) como agente fluorogénico de reconocimiento de secuencias de ADN.