INTERNALIZACIÓN Y ACTIVACIÓN FOTOCONTROLADA DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS CAPACES DE UNIRSE AL ADN DE DOBLE HEBRA.

La presente invención se refiere a compuestos formados por una molécula pequeña capaz de unir al ADN de doble hebra conjugada covalentemente a un grupo protector fotolábil,

y a sus usos. La desprotección de estos compuestos mediante irradiación con luz permite controlar de forma espacial y temporal la activación de dichas moléculas de unión al ADN.

INTERNALIZACIÓN Y ACTIVACIÓN FOTOCONTROLADA DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS CAPACES DE UNIRSE AL ADN DE DOBLE HEBRA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos que permiten la activación controlada, espacial y temporalmente, de moléculas pequeñas de unión al ADN de doble hebra, así como a sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La molécula de ADN está implicada en numerosos procesos básicos para la vida de la célula y es la diana terapéutica con la que interaccionan numerosos fármacos.

A través de esta interacción, se producen cambios físico-químicos en el ADN que pueden tener importantes consecuencias en las diversas actividades en las que la molécula de ADN interviene. Como resultado, los compuestos capaces de unirse al ADN constituyen herramientas de gran utilidad tanto en el ámbito diagnóstico como terapéutico.

Estas moléculas de unión al ADN pueden provocar la activación, modulación o inhibición de la función del ADN. Habitualmente actúan provocando la inhibición de procesos básicos para la supervivencia de la célula como la transcripción o replicación, provocando la muerte celular. Por ello, este tipo de moléculas se han empleado en quimioterapia y para el tratamiento de enfermedades bacterianas, virales, fúngicas y parasitarias, entre otros. Además el ADN es una de las dianas más habituales de muchos de los fármacos anticáncer usados en quimioterapia.

Sin embargo, algunas de estas moléculas presentan una baja especificidad de tejido celular, atacando no sólo a la célula cancerosa o al microorganismo sino también a células sanas o células del hospedador, respectivamente.

Con el fin de disminuir la alta toxicidad que conlleva el empleo de moléculas de unión al ADN, existe la necesidad de desarrollar métodos que permitan controlar de forma eficaz la actividad de dichas moléculas, tanto en términos de espacio, como de tiempo.

Los documentos Current Opinion in Chemical Biology 2009, 13, 678-686 y Organic & Biomolecular Chemistr y 2007, 5, 999-1005, describen el empleo de grupos protectores sensibles a la luz para controlar la activación de moléculas biológicas, como inductores de la expresión génica, oligonucleótidos o proteínas.

La publicación Tetrahedron Letters 2003, 44, 7307-7309, describe un derivado de Berenilo que, tras irradiación con luz, descompone en 4-amidino-N- (3hidroxipropil) anilina y el catión 4-amidinobenzenodiazonio. Este último podría producir ruptura del ADN. El derivado de Berenilo descrito en este documento es capaz de interaccionar con el ADN y, por tanto, no puede utilizarse para controlar la inactivación y posterior activación en el lugar y momento deseado de la sal de diazonio 4amidinobenzenodiazonio.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han descubierto que la utilización de grupos protectores fotolábiles permite inactivar temporalmente la actividad de moléculas pequeñas que interaccionan selectivamente con ADN de doble hebra. El compuesto protegido resultante no es capaz de unirse al ADN de doble hebra, con lo cual es posible disponer de un derivado no activo que se puede manejar cómodamente, y que se libera en el momento y lugar precisos en los que se desee que actúe mediante irradiación con luz, induciendo así la interacción de la molécula pequeña con el ADN de forma controlada.

De esta forma, es posible activar las moléculas pequeñas de unión al ADN de doble hebra de forma eficaz y controlada.

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se dirige a un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra, conjugada covalentemente a un grupo protector fotolábil, con la condición de que dicho compuesto no sea a su vez una molécula de unión al ADN de doble hebra.

En otro aspecto, la invención se dirige al uso de un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra unida covalentemente a un grupo protector fotolábil, para el control in vitro de la expresión génica y/o la síntesis de proteínas.

Estas moléculas pequeñas que unen ADN provocan un cambio en la estructura y/o funcionalidad de la molécula de ADN de doble hebra cuando interaccionan con ella, impidiendo procesos básicos para la supervivencia y proliferación de la célula, como por ejemplo la transcripción y replicación. Por ello, este tipo de moléculas pequeñas de unión al ADN de doble hebra tienen importantes aplicaciones como antitumorales, antibacterianos, antivirales, antifúngicos y antiparasitarios, entre otros.

Por tanto, en otro aspecto la invención se refiere al uso de un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra unida covalentemente a un grupo protector fotolábil, para la preparación de un medicamento. Este medicamento puede ser un medicamento de acción controlada, es decir, un medicamento cuya actividad puede activarse de forma controlada en el momento y/o lugar deseado mediante irradiación con luz.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra unida covalentemente a un grupo protector fotolábil, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas o de enfermedades microbianas.

En otro aspecto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra unida covalentemente a un grupo protector fotolábil, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por otro lado, las características espectrales de algunas moléculas pequeñas que unen ADN de doble hebra cambian al unirse al ADN y, por ello, son útiles como marcadores o colorantes de ADN.

Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra unida covalentemente a un grupo protector fotolábil, para marcar in vitro zonas específicas del ADN y/o células.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Izquierda: la línea sólida representa el espectro de HPLC del compuesto protegido ©1 en solución tampón Tris-HCl buffer 20 mM; 100 mM NaCl; pH 7.5; la línea de trazos representa el espectro de HPLC de la misma disolución tras irradiar durante 15 min con luz UV. Derecha: espectro de emisión de fluorescencia al aumentar el tiempo de irradiación de una disolución 0, 5 μM de ©1 en tampón HEPES 50 mM, NaCl 100 mM en presencia del oligonucleótido horquilla (hairpin) que contiene la secuencia diana AAATTT (5 μM) . Secuencia de la horquilla AAATTT: 5’-GGCG AAATTT CGC TTTTT GCG AAATTT CGCC-3’ (SEQ ID NO: 1) .

Figura 2. Arriba: espectro de emisión de fluorescencia de una disolución 0, 8 μM de ©2 en tampón Tris-HCl buffer 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7, 5 al aumentar el tiempo de irradiación. Abajo: microscopía de emisión de fluorescencia de células pertenecientes a la línea celular Vero (12, 5 μM ©2 tras 15 min de incubación) ; A: antes de irradiación y desprotección, B: tras desprotección mediante irradiación con luz UV durante 10 min, C: experimento control con 12, 5 μM de 2 tras 15 min. de incubación.

Figura 3. Arriba: microscopía de fluorescencia de células pertenecientes a la línea Vero incubadas con el compuesto ©2, tras incrementar los tiempos de irradiación (λexc ≥ 365 nm) . Abajo: A) Placa de cultivo donde las células están formando una monocapa antes de la irradiación; B) mismo cultivo después de la irradiación a través de un molde de cartulina. Estas fotos se tomaron sobre las muestras irradiadas con un transiluminador.

Figura 4. Izquierda: Microscopía de fluorescencia de células Vero incubadas con 50 μMde ©3 mostrando la desprotección y redistribución de la fluorescencia desde la membrana nuclear al núcleo (t=0 imagen con luz blanca y fluorescencia, t=4 min hasta t=16 min imágenes de fluorescencia) . Derecha: Representación esquemática de la propuesta de dinámica de activación del compuesto ©3.

Figura 5. Control del efecto de la irradiación UV sobre el bromuro de etidio. A: Bromuro de etidio 50 microM antes de ser irradiado. B: después de ser irradiado, donde se observa claramente que no sufre variación alguna y se presenta en el núcleo celular.

Figura 6. Control del efecto de la irradiación UV sobre ©2 (Nvoc2-ethidium) 50 microM. A: imagen con luz blanca. B: antes de la irradiación. C: después de 15 minutos de irradiación. Se observa que ©2 no es visible con los cubos ópticos del microscopio que abarcan el rojo; sólo después de la irradiación... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto formado por una molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra que está unida covalentemente a un grupo protector fotolábil, con la condición de que dicho compuesto no sea a su vez una molécula de unión al ADN de doble hebra.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde la molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra se selecciona de entre un agente intercalante, un agente alquilante o un molécula de unión al surco menor.

3. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra es un colorante de ADN, un agente antitumoral o un agente antimicrobiano.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra es un compuesto de fórmula (Ia) o (Ib) :

HN NH

AXB

H2NAXB NH2

NH2H2N

(Ia) (Ib) donde A y B se seleccionan cada uno independientemente de arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos; X puede no existir, de forma que A y B se encuentren condensados, o representa un enlace, -O-, -S-, -NH-, -O-Y-O-, -S-Y-S-, -NH-Y-NH-, o un alquilo C1-C6, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituidos; Y se selecciona de alquilo C1-C8, arilo y heteroarilo opcionalmente sustituidos,

o una sal o solvato del mismo.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula pequeña de unión al ADN de doble hebra se selecciona de entre pentamidina, azapentamidina, bromuro de etidio y 4’, 6-diamidinio-2-fenilindol.

6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el grupo protector fotolábil es un compuesto de fórmula (II) :

(II)

donde n se selecciona de 0, 1, 2, 3 y 4; R1 y cada R2 se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, ar ilo C6-C15, heteroarilo C3-C15 y heterociclo C3-C15 opcionalmente sustituidos, NO2, CN, halógeno, -OR’, -SR’, -S (O) R’, -S (O) 2R’, OS (O) 2R’, -N (R’) (R’’) , -C (O) R’, -C (O) OR’, -C (O) N (R’) (R’’) , -OC (O) R’ y -N (R’) C (O) R’’; donde cada R’ y R’’ se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C7, arilo C6-C15, heteroarilo C3-C15 y heterociclo C3-C15 opcionalmente sustituidos;

o dos grupos R2 forman, junto con el anillo de fenilo al que están unidos, un grupo heterociclo.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde: n se selecciona de 0, 1 y 2; R1 se selecciona de entre hidrógeno, metilo, trifluorometilo y carboxilo; R2 representa metoxilo, o dos radicales R2 contiguos forman un grupo –O-CH2-O-.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos uno de R1 y R2 comprende un grupo ionizable a pH fisiológico.

9. Compuesto según la reivindicación anterior, donde al menos uno de R1 y R2 es un grupo carboxilo.

10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el grupo protector fotolábil se selecciona de:

CO2H O O MeO O

O

NO2 y MeO NO2 .

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores seleccionado de entre un compuesto de fórmula (IIIa) y (IIIb) :

HN NH

R1 O

O R1

AXB O N N

O

H H (R2) n

(R2) n NO2 O2N

(IIIa)

R1

O OR1

AXBON

O

N (R2) n

(R2) n NO2

H H O2N

(IIIb) donde A, B, X, n, R1 y R2 son tal y como se han definido en las reivindicaciones 10 anteriores.

12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores seleccionado de:

HO2C O NH NHO CO2H OO

MeO

OMe O N N

O

H H

© 2

MeO NO2

O 2N OMe N ,

Ph

CF3COO

NH O

O HN

OMe MeO N O

N

© 3

HO N HH

O 2N OMe ,

MeO NO2 HH

O NH NHO

o una sal o solvato del mismo.

13. Uso de un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para el control in vitro de la expresión génica y la síntesis 5 de proteínas.

14. Uso de un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para marcar in vitro secuencias de ADN o células.

15. Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. Uso de un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 12, para preparar un medicamento.

17. Uso de un compuesto tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades proliferativas o de enfermedades microbianas.

18. Uso según la reivindicación 17, donde la enfermedad proliferativa es cáncer.

19. Uso según la reivindicación 17, donde la enfermedad microbiana es una enfermedad bacteriana, viral, fúngica o parasitaria.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Figura 4

Figura 5

Figura 6

Figura 7

Figura 8

Figura 9

OFICINA ESºAAOLA DE ºATENTES Y MARCASº N.° solicitud: º

ESºAAAº

Fecha de presentación de la solicitud: ºº. .ººº

Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

Int. Cl. Ver Hoja Adicional INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoria @ Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A WO ºººººº7º ºº Aº ºUNIV. SANTIAGO DE COMºOSTELA) ºº. ºº. º, ººº9

reivindicaciones ººº.

A O. V AZQUEZ e t a l., " Bisº ººaminobenmamidines: V ersatile, fluorogenic AfT selective dsD NA ººº9

binders", Organic Letters, ºº, vol. ºº, n° º, paginas 6 ºº9.

A O. VAZQUEZ et al., "dsDNA Triggered energy transfer and lanthanide sensitimation processes. ººº9

Luminescent probing of specific AfT sequences", Chem. Commun., ºººº, vol. º6,

paginas º.

A W. T. MONROE et al., "Targeting expression with light using caged DNA", Journal of Biological ººº9

Chemistr y , º999, vol. º7º, n° ºº, paginas º9ºº ºº9 ºº.

A H. YU et al., "Chemistr y and biological applications of photoºlabile organic compounds", Chem. ººº9

Soc. Rev., ºººº, vol. º9, paginas º6 7º.

Categoria de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otrofs de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgación no escrita º: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado º para todas las reivindicaciones º para las reivindicaciones n°:

Fecha de realización del informe ºº.ºº.º Examinador E. Davila Muro Pagina ºfº

N° de solicitud:

CLASIFICACION OBJETO DE LA SOLICITUD

C07C257118 ºººº6.ºº) C07D221106 ºººº6.ºº) C07D209114 ºººº6.ºº) A61K311155 ºººº6.ºº) A61K311404 ºººº6.ºº) A61K311435 ºººº6.ºº) G01N21177 º ººº6.ºº)

Documentación minima buscada ºsistema de clasificación seguido de los simbolos de clasificación)

Cº7C, C º7D, A6º, , G ººN

Bases de datos electrónicas consultadas durante la busqueda ºnombre de la base de datos y, si es posible, terminos de busqueda utilimados)

INVENES, EºODOC, WºI, XºESº, NºL, REGISTRY, CA ºLUS, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, ºUBMED

Informe del Estado de la Tecnica agina ºf

OPINION ESCRITA

N° de solicitud: ººººººººº

Fecha de Realimación de la Opinión Escrita: ºº.ºº.º

Declaración Novedad (Art. .1 LP 11/198 ) Reivindicaciones ºº9 SI Reivindicaciones NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 ) Reivindicaciones ºº9 SI Reivindicaciones NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud ºArticulo ºº.º Ley ºfº9º 6) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realimado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

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OPINION ESCRITA

N° de solicitud: ººººººººº

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la tecnica tomados en consideración para la realimación de esta opinión.

Documento Numero Publicación o Identificación Fecha Publicación

Dºº WO 7ºº A ºº.ºº.º

Dºº O. VAZQUEZ et al., Org. Lett., ºººº, vol. ºº, n° º, pgs. ºº6ººº9

Dºº O. VAZQUEZ et al., Chem. Commun., ºººº, vol. º6, pgs

Dºº W. T. MONROE et al., J. Biol. Chem., º999, vol. º7º, n° ºº, pgs. 9ºº 9ºº

2. Declaración motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La invención se refiere a un compuesto formado por una molecula pequefa de unión al ADN de doble hebra unida covalentemente a un grupo protector fotolabil. La invención tambien se refiere a una composición farmaceutica que contiene el compuesto, asi como a los usos del compuesto para el control in vitro de la expresión genica y sintesis de proteinas, para el m arcado in vi tro de s ecuencias de ADN y para l a preparación d e un m edicamento ut ilimable en e l t ratamiento d e enfermedades proliferativas o microbianas.

El documento Dºº divulga compuestos con estructura de bis aminobenmamidinas, su procedimiento de obtencióny uso como agentes fluorogenicos de reconocimiento de secuencias de ADN debido a su capacidad para actuar como moleculas de unión al surco menor del ADN de doble hebra. La diferencia entre los compuestos ama pentamidina descritos en D y los de l a i nvención r adica en qu e l os primeros no est an un idos covalentemente a un gr upo pr otector f otolabil º ver compuestos Ia y Ib) .

El documento Dºº divulga tambien derivados fluorogenicos de bis aminobenmamidinas que presentan un aumento de su emisión de fluorescencia cuando se unen especificamente a sitios AfT del surco menor del ADN de doble hebra, por lo que resultan utiles para el reconocimiento de dichas secuencias ºver Esquema º) .Como en el caso del documentoD ºº, la diferencia entre los compuestos descritos y los de la invención radica en que los primeros no estan unidos covalentemente a un grupo protector fotolabil.

El doc umento D divulga un co mplejo f ormado por un der ivado d e bi s ººaminobenmamidina c on un s ustituyente ºalcoxiaminopropano uni do c ovalentemente a un co njugado m acrociclico D OTA[Ln ºº] o un der ivado de cu marina, co n capacidad como aceptores fluorófobos ºver Esquemas y . Estos compuestos actuan sobre los procesos de transferencia de energia inducidos por sitios especificos del ADN de doble helice. En este caso tampoco el sustituyente unido se trata de un grupo protector fotolabil.

El documento Dºº divulga la activaciónfinactivación de un plasmido deADN que tiene unido covalentemente un grupo protector fotolabil º, ººdimetoxiººº nitrofenil) diamoetano ºDMNºE) . La fotoactivación con lum UV permite el control de la expresión del plasmido y su uso potencial como marcador de secuencias ºver paginas ºº9 9º º) . Aunque en este caso el grupo protector fotolabil es de tipo o-nitrofeniletilo sustituido, la diferencia con los compuestos de la invención radica en que no se trata de una molecula pequefa de unión al ADN ºalquilante, intercalante o molecula de unión al surco menor) .

Los documentos citados muestran sólo el estado de la tecnica del campo al que pertenece la investigación. Ninguno de los documentos D ººD ºº, tomados solos o en combinación con los otros, revela ni contiene sugerencia alguna que dirija al experto en la materia hacia un compuesto formado por una molecula pequefa de unión al ADN unida covalentemente a un grupo pr otector f otolabil º reivindicación i ndependiente º) , ni hac ia una co mposición f armaceutica que c ontenga di cho compuesto ºreivindicación independiente ) , ni tampoco el uso del mismo para el control in vitro de la expresión genica y sintesis de pr oteinas ºreivindicación independiente ºº) , para el m arcado in v itro de se cuencias de A DN o ce lulas ºreivindicación independiente ºº) , o para la preparación de un medicamento utilimable en el tratamiento de enfermedades proliferativas o microbianas ºreivindicaciones independientes º6 y 7) .

ºor lo tanto, el objeto de la invención segun las reivindicaciones º9 se considera que cumple los requisitos de novedad y actividad inventiva recogidos en los arts. 6. y º.º Lº ºfº9 º6.

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