SISTEMA PARA ANALISIS SIMPLIFICADO DE ACIDOS NUCLEICOS.

Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las etapas:

(a) Purificar los ácidos nucleicos en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos son inmovilizados y se separan las impurezas,

(b) Eluir los ácidos nucleicos inmovilizados,

(c) Amplificar los ácidos nucleicos purificados en un recinto de amplificación, de manera que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión,

(d) Detección de los productos de amplificación en un recinto de detección, caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o, como mínimo, una parte del recinto de unión

Sistema para análisis simplificado de ácidos nucleicos.

La presente invención se refiere a un sistema para el análisis simplificado de ácidos nucleicos.

En sistemas conocidos de análisis de ácidos nucleicos se lleva a cabo, en primer lugar, una unión de ácidos nucleicos para la purificación o aislamiento de los analitos buscados. La unión tiene lugar habitualmente en recipientes con volúmenes relativamente grandes, de algunos centímetros cúbicos, para poder recibir las cantidades necesarias para una detección sensible de la muestra, tampón de unión, etc. Puesto que en el área de diagnóstico se deben alcanzar límites de detección de 1 a 10 analitos por ml de muestra, para procedimientos diagnósticos sensibles son necesarias cantidades correspondientemente grandes de muestra y, por lo tanto, grandes volúmenes de reacción. Los volúmenes de muestra más pequeños conducen a procedimientos menos sensibles y al peligro de que en la parte escogida en la muestra realmente positiva, el analito buscado no se encuentre allí, lo que podría conducir a un resultado de diagnóstico llamado falso negativo.

Por otra parte, la amplificación del ácido nucleico necesaria para la detección de los analitos de ADN aislados debe ser realizada, no obstante, en recipientes lo más reducidos posible para conseguir una velocidad de amplificación suficientemente elevada. Este contraste, tiene como consecuencia que los ácidos nucleicos, inmovilizados para la depuración, se eluyen habitualmente hacia fuera del recinto de unión y deben ser transferidos a un recinto de amplificación que es distinto al recinto de unión. Se dan a conocer dispositivos para análisis de ácidos nucleicos con sistemas de recintos múltiples, por ejemplo, en los documentos EP 0 754 725; WO 95/11454; US 5,645,801; WO 97/02357; US 5,714,380; EP 0 733 714; EP 0 674 009; US 5,725,831; US 5,639,428; WO 97/10056; WO 94/05414; WO 96/41864; US 5,589,136; WO 97/00726; EP 0 838 025; WO 97/03348; EP 0 594 260; EP 0 594 259; US 5,288,463; US 5,422,271; US 5,593,838; WO 93/22053; WO 93/22054; WO 93/22055; WO 93/22058 y WO 96/15269. La fase de transferencia necesaria para estos dispositivos de los ácidos nucleicos aislados de un recipiente a otro está relacionada, no obstante, con medidas adicionales y con el peligro de que en la transferencia una parte, o la totalidad, del analito buscado se pierda o que contamine la muestra.

El documento US 5,955,351 da a conocer un dispositivo cerrado, de recintos múltiples, para el análisis de ácido nucleico, en el que tiene lugar una extracción de ácido nucleico, amplificación y detección, en varios recintos de reacción móviles entre sí. La preparación y la detección de los ácidos nucleicos a investigar tienen lugar dentro de recintos separados entre sí del dispositivo. El volumen de muestra a analizar está, por lo tanto, limitado al volumen del recinto de unión.

Existe, por lo tanto, la necesidad de un procedimiento de análisis de ácidos nucleicos mediante el cual se pueden superar los inconvenientes del procedimiento conocido y que presente especialmente una elevada sensibilidad y con el cual se pueden reducir la complicación técnica y necesidad de tiempo para un análisis.

Este objetivo se consigue mediante un procedimiento para la detección de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las siguientes fases:

(a) purificación de los ácidos nucleicos en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos son inmovilizados y las impurezas son eliminadas,

(b) elución de los ácidos nucleicos inmovilizados,

(c) amplificación de los ácidos nucleicos purificados en un recinto de amplificación, de manera que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de purificación, y

(d) detección de los productos de amplificación en un recinto de detección;

que se caracteriza porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación o/y una parte del recinto de unión.

A causa de la realización de la amplificación, como mínimo, en una parte del recinto de unión, se puede conseguir una sustancial mejora con respecto a la complicación técnica y necesidad de tiempo en los análisis de ácidos nucleicos. De acuerdo con la invención, el mismo recinto, o una parte de éste, puede ser utilizado tanto para la inmovilización como también para la amplificación, de manera que la muestra, en el caso en que se desee mezclada con otros reactivos, es guiada a efectos de inmovilización, como mínimo, una vez, y preferentemente varias, a través del recinto de unión.

Básicamente, los sistemas para el análisis de ácidos nucleicos comprenden una o varias de las siguientes fases: preparación de la muestra, amplificación, detección y evaluación.

La preparación de la muestra puede tener lugar, en caso deseado, antes de la purificación del ácido nucleico en la etapa (a) una lisis de muestras que contienen ácidos nucleicos. Esta lisis será llevada a cabo, preferentemente, cuando las muestras a investigar contienen células y/o restos de células. La lisis de células puede tener lugar, por ejemplo, mediante añadidura de reactivos de litio, en especial reactivos caotrópicos o encimas líticas. En una forma de realización especialmente preferente se colocará en una jeringa de doble émbolo un reactivo caotrópico. La muestra será aspirada hacia dentro de la jeringa y, finalmente, la abertura de inyección será cerrada, por ejemplo, mediante una válvula o un grifo. Mediante movimiento de avance y retroceso del segundo émbolo de la jeringa de doble émbolo, se conseguirá una mezcla intensa de la muestra que contiene ácido nucleico y el reactivo caotrópico. En caso deseado, la lisis puede tener lugar mediante calentamiento de la mezcla a una temperatura más elevada, preferentemente de 30ºC a 70ºC. La lisis se efectuará preferentemente por la acción de fuerzas de cizalladura sobre la muestra que contiene el ácido nucleico.

Además, la preparación de la muestra comprende una etapa de purificación a efectos de separar, en la mayor medida posible, los componentes que perturban la detección posterior. La purificación de los ácidos nucleicos será llevada a cabo, de acuerdo con la presente invención, en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos serán inmovilizados y las impurezas serán separadas. Los ácidos nucleicos pueden ser inmovilizados, por ejemplo, mediante unión covalente o de absorción en el recinto de unión. Además, también es posible la unión de los ácidos nucleicos mediante una interacción de alta afinidad, por ejemplo, una unión específica de secuencia mediante sondas de hibridación o un asociado de unión de pares de unión de alta afinidad, tales como adivina/biotina, o mediante anticuerpos específicos. De manera preferente, la inmovilización de los ácidos nucleicos tiene lugar mediante unión de adsorción, por ejemplo, sobre la superficie de un vidrio. La unión de los ácidos nucleicos a la superficie puede ser reforzada mediante la añadidura de los reactivos de unión adecuados, tales como, por ejemplo, isopropanol, sales caotrópicas, etc.

La unión tiene lugar, de manera preferente, en una superficie interna del recinto de unión, pero también es posible efectuar la unión de los ácidos nucleicos sobre dispositivos introducidos en el recinto de unión, tales como recubrimientos o rellenos.

En caso de que se deba analizar una muestra que contiene células, por ejemplo, microorganismos, puede ser ventajoso unir, en primer lugar, las células, por ejemplo, microorganismos infecciosos, con intermedio de anticuerpos específicos de antígenos superficiales o unión por absorción no específica a la superficie del recinto de unión. Así, por ejemplo, para una unión específica de microorganismos, tal como, por ejemplo, organismos infecciosos, se pueden inmovilizar correspondientes anticuerpos en el recinto de unión. Se ha podido demostrar que las células, tales como, por ejemplo, clamidias, se unen de forma absorbente sobre superficies, preferentemente superficies de poliestireno y, de esta manera, pueden ser separados en la purificación. Los ácidos nucleicos en sí mismos pueden ser detectados, entonces, después una lisis de las células, que puede tener lugar, por ejemplo, mediante la acción térmica durante la reacción de amplificación.

Es especialmente preferente como recinto de unión un recinto que, como mínimo, es parcialmente capilar. En una forma de realización preferente tiene lugar la inmovilización de los ácidos nucleicos o células...

1. Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las etapas:

(a) Purificar los ácidos nucleicos en un recinto de unión, de manera que los ácidos nucleicos son inmovilizados y se separan las impurezas,

(b) Eluir los ácidos nucleicos inmovilizados,

(c) Amplificar los ácidos nucleicos purificados en un recinto de amplificación, de manera que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión,

(d) Detección de los productos de amplificación en un recinto de detección,

caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o, como mínimo, una parte del recinto de unión.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque, como mínimo, una parte de un recinto capilar es utilizada como recinto de unión y/o amplificación.

3. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en la etapa (a) se lleva a cabo una absorción de ácidos nucleicos sobre una superficie de vidrio.

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para la elución en la etapa (b) se utiliza una solución que contiene todos los reactivos necesarios para la amplificación.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el recinto de amplificación puede estar termostáticamente controlado.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque el recinto de amplificación está rodeado por una capa metálica calentable.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado porque el recinto de amplificación está rodeado por una capa de metal completa.

8. Procedimiento, según la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque se utiliza como recinto de amplificación un capilar de vidrio y/o poliestireno, que está rodeado por una capa metálica calentable.

9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se lleva a cabo, antes de la etapa de purificación de ácidos nucleicos en la etapa (a), una degradación o lisis de las muestras que contienen los ácidos nucleicos.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado porque para la degradación de una matriz que contiene ácido nucleico se hace pasar una mezcla de degradación que comprende la matriz que contiene el ácido nucleico y un agente de degradación a través de un recinto capilar, de manera que la matriz es rota y los ácidos nucleicos contenidos en la misma son liberados.

11. Procedimiento, según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado por la utilización de un reactivo de degradación que contiene una encima lítica y/o una sustancia caotrópica.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el recinto capilar es un capilar de vidrio y/o un capilar de poliestireno.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado porque el recinto capilar es un capilar recubierto con borosilicato.

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque la muestra se hace pasar varias veces a través del recinto capilar.

15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado porque la proporción de volumen de la mezcla de degradación al recinto capilar es superior a 10:1.

16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra comprende células y/o fracciones de células.

17. Procedimiento, según la reivindicación 16, caracterizado porque las células están unidas a una superficie de poliestireno.

18. Procedimiento, según la reivindicación 17, caracterizado porque para obtener ácidos nucleicos a partir de microorganismos se establece contacto de una muestra que contiene microorganismos con una superficie de poliestireno en condiciones en las que los microorganismos se unen a la superficie de poliestireno y otros componentes de la muestra son separados y los ácidos nucleicos son obtenidos a partir de los microorganismos.

19. Procedimiento, según la reivindicación 18, caracterizado porque se añade además una sal para facilitar la unión de los microorganismos a la superficie de poliestireno.

20. Procedimiento, según la reivindicación 18 ó 19, caracterizado por la utilización de un capilar de poliestireno.

21. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque la muestra es obligada a pasar varias veces sobre la superficie de poliestireno.

22. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque los microorganismos son clamidias.

23. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque se utiliza orina como muestra.

24. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la purificación del ácido nucleico, la amplificación de los ácidos nucleicos purificados y la detección de los productos de amplificación se llevan a cabo en el mismo recinto de reacción.

25. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque todas las etapas son llevadas a cabo en un aparato cerrado.

26. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, para detectar patógenos en muestras biológicas.

27. Aparato para la detección de ácidos nucleicos en una muestra, particularmente, por un método, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende:

(a) un recinto de unión para purificar ácidos nucleicos en el que los ácidos nucleicos son inmovilizados y las impurezas son separadas,

(b) un recinto de amplificación para amplificar ácidos nucleicos en el que el recinto de amplificación comprende, como mínimo, una parte del recinto de unión,

(c) un recinto de detección para detectar ácidos nucleicos y opcionalmente,

(d) recipientes y/o conducciones de alimentación para la muestra y/o para los reactivos, caracterizado porque el recinto de detección comprende, como mínimo, una parte del recinto de amplificación y/o del recinto de unión.

28. Aparato según la reivindicación 26 o 27, caracterizado porque el recinto de unión y/o el recinto de amplificación son, por lo menos parcialmente, un recinto capilar.

29. Aparato, según la reivindicación 28, caracterizado porque el recinto de amplificación está rodeado por una capa metálica calentable.