AISLAMIENTO DE MOLECULAS DE ADN USANDO LIGANDO MERCAPTO-ARILO.

Un procedimiento para separar ADN plasmídico circular cerrado covalentemente de ADN plasmídico circular abierto y/o de ARN mediante 5 cromatografía líquida a pH 6,

5-8,5 que comprende las etapas de (a) someter una mezcla de moléculas de ácido nucleico a una matriz de una superficie portadora a la que se ha anclado un ligando S-arilo seleccionado del grupo que consiste en piridino-2-tiol; piridin-2-ilmetanotiol; 2-piridin-2-iletanotiol; bencenotiol; pentafluorobencenotiol; hidrosulfuro de bencilo; 2,4- difluorobencenotiol; hidroxi(4-mercaptofenil)oxoamonio; 4-(metiltio)bencenotiol; y 4-metoxibencenotiol para unir el ADN plasmídico circular cerrado, mientras el ADN plasmídico circular abierto y/o el ARN no se unen a una conductividad superior a 220 mS/cm; (b) eluir el ADN plasmídico circular cerrado covalentemente aplicando un gradiente de conductividad decreciente; y (c) opcionalmente lavar el portador con una solución adecuada; donde las moléculas de ácido nucleico comprenden ADN plasmídico circular abierto 20 (oc), ADN plasmídico circular cerrado covalentemente (ccc), ADN genómico, y ARN

Campo Técnico

La presente invención hace referencia a un procedimiento para separar moléculas de ácido nucleico, tales como ADN plasmídico en una solución. Más específicamente, el presente procedimiento se basa en la separación de ADN oc (abierto circular, por sus siglas en inglés) y ADN ccc (circular cerrado covalentemente) superenrollado así como ácidos ribonucleicos y otros ácidos desoxirribonucleicos entre sí y de otros componentes presentes en una solución.

Antecedentes

10 El desarrollo de la terapia génica y las vacunas de ADN ha incrementado la demanda de vectores génicos altamente purificados tales como ADN plasmídico. El problema con la purificación del ADN plasmídico superenrollado es separar completamente otros componentes celulares tales como las proteínas del anfitrión, las endotoxinas, el ADN cromosómico, el ARN, las formas circulares abiertas y con muescas del ADN plasmídico. Se han utilizado diferentes métodos cromatográficos para la purificación de ADN plasmídico, tales como la cromatografía de exclusión por tamaños, o la filtración en gel, hidroxiapatita, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en fase reversa y cromatografía de interacción hidrófoba. La mayor parte de los métodos carece de la posibilidad de separar el ADN plasmídico superenrollado de otras formas del plásmido. Muchos de los métodos asequibles también utilizan ARNasa para hidrolizar el ARN en el producto lisado aclarado antes de aplicar la muestra a la columna cromatográfica. El uso de ARNasa no es recomendable en la preparación de ADN plasmídico que está

25 destinado a su uso en seres humanos. La cromatografía de intercambio iónico es el método de cromatografía más comúnmente utilizado. El ADN plasmídico, el ADN cromosómico y el ARN se unen todos a intercambiadores aniónicos ya que tienen propiedades de carga similares. También se ha utilizado la cromatografía de interacción hidrófoba, no obstante, el ADN

30 plasmídico no se une y eluye en el flujo directo. El documento WO 97/25139 (Massey University) hace referencia a un método de síntesis con resina que puede proporcionar elevados niveles de activación a una variedad de matrices de soporte. Un objetivo es evitar el uso de condiciones de activación con haluros, que se sabe que proporcionan intermedios que carecen de especificidad. Se ha establecido que la resina preparada de acuerdo con el documento WO 97/25139 es útil para prácticamente cualquier objetivo.

El documento EP 0 168 363 (Porah) hace referencia a adsorbentes para el aislamiento de macro- y micro-moléculas y para la inmovilización p. ej. de enzimas para aplicaciones técnicas, así como antígenos y anticuerpos para la diagnosis de enfermedades. Se ha establecido que los adsorbentes están particularmente bien adaptados para el fraccionamiento de proteínas del suero.

El Journal of Chrom B, 664 (1995), 83-88 (Schwartz) hace referencia a ligandos heterocíclicos para la purificación tiofílica de anticuerpos, y más específicamente a una optimización de la concentración de ligandos para la adsorción eficaz y la elución de anticuerpos a partir de ascitis y suero.

Compendio de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para el aislamiento de ADN plasmídico superenrollado que evite una o más de las desventajas comentadas antes. De este modo, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para el aislamiento de moléculas de ácido nucleico sobre una matriz, que sea eficaz. El objeto de la invención se obtiene más específicamente por medio del procedimiento definido en las reivindicaciones adjuntas, y por medio de la matriz de las reivindicaciones adjuntas.

Definiciones

En la presente memoria se entiende que el término "molécula de ácido nucleico" incluye moléculas grandes y agregados de moléculas, tales como ADN plasmídico circular abierto, ADN plasmídico superenrollado y otros ADN (p. ej. ADN genómico) así como ARN, tal como ARNm, ARNt y ARNs.

El término "eluyente" se utiliza en la presente memoria con su significado convencional en cromatografía, esto es, una solución capaz de perturbar la interacción 30 entre la fase sólida (matriz adsorbente) y el producto (moléculas de ácido nucleico) y

promover la disociación selectiva del producto de la fase sólida.

Se debe entender que cualquier término utilizado en la presente memoria, pero no definido específicamente en la presente memoria, debe ser interpretado de acuerdo con el significado general comprendido por los expertos en el presente campo técnico.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra ejemplos de compuestos de aril-S que se pueden hacer reaccionar con Sepharose 6 Fast Flow, cuyos compuestos poseen propiedades de separación. La Figura 2 muestra los dos cromatogramas obtenidos después de cargar respectivamente 130 y 150 ml de producto lisado aclarado sobre Sephacryl S500 HR, realizados en sulfato de amonio 2M. El inserto muestra el análisis de la electroforesis en gel de agarosa de fracciones seleccionadas así como una alícuota de la sustancia de partida. Las Figuras 3A, B y C ilustran los resultados obtenidos después de la cromatografía sobre Sepharose 6 Fast Flow con numerosos ligandos de aril-S diferentes, como se indica en los cromatogramas. Los insertos muestran el análisis mediante electroforesis en gel de agarosa de las fracciones seleccionadas. La Figura 4 ilustra los resultados obtenidos después de la cromatografía sobre Sepharose 6 Fast Flow con numerosos ligandos de aril-S diferentes, como se indica en los cromatogramas. La Figura 5 presenta el cromatograma obtenido después de cargar la muestra (previamente purificada mediante filtración en gel) sobre Piridil-S Sepharose 6 Fast Flow en condiciones de conductividad elevada (>240 mS/cm). La Figura 6 muestra los resultados obtenidos después de realizar la cromatografía del producto lisado aclarado sobre Piridil-S Sepharose 6 Fast Flow en una columna XK16/15. La Figura 7 es un cromatograma que demuestra el uso de Na2SO4 durante la adsorción del ADN plasmídico a un ligando S-arilo de acuerdo con la invención.

Descripción Detallada de la Invención

30 En un primer aspecto, la presente invención hace referencia a un procedimiento para separar moléculas de ADN plasmídico circulares cerradas covalentemente de ADN plasmídico circular abierto y/o ARN mediante cromatografía líquida a pH 6,5-8,5, que comprende las etapas de (a) someter una mezcla de moléculas de ácido nucleico a una matriz de una superficie portadora provista de un ligando S-arilo;

(b) someter las moléculas de ácido nucleico a una etapa de elución;

(c) aislar las diferentes fracciones que contienen las diferentes moléculas de ácido nucleico;

y opcionalmente lavar el portador con una solución adecuada. De este modo, durante la etapa (a), se permite que las moléculas de ácido nucleico adsorban los ligandos de S-arilo. El lavado se realiza después de la adsorción pero antes de la elución, como es bien sabido en la técnica, con el fin de eliminar la sustancia no deseada. Naturalmente, el presente procedimiento también se puede utilizar en los casos en los que el ácido nucleico es un componente no deseado de una solución, esto es, para proporcionar una solución purificada de ácido nucleico. En ese caso, se realiza la elución de las moléculas de ácido nucleico para la regeneración de

15 la columna. Por consiguiente, el método para la purificación de una solución de acuerdo con la invención no incluye necesariamente una etapa de elución. En una realización, el procedimiento de acuerdo con la invención es un aislamiento de moléculas de ácido nucleico expresadas en células, y, por consiguiente, también comprende una primera etapa de disgregación de las células para proporcionar la solución que comprende las moléculas de ácido nucleico. Tal disgregación se realiza, p. ej. mediante lisis, tal como lisis alcalina, de acuerdo con los protocolos convencionales (véase, p. ej. Maniatis, T, Fritsch, E.F. y Sambrook J. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY).

25 El presente procedimiento comprende la etapa de eluir las moléculas de ADN plasmídico superenrolladas poniendo en contacto un eluyente adecuado con dicha matriz. De este modo, la etapa de elución se puede realizar como un procedimiento dinámico o por...

1. Un procedimiento para separar ADN plasmídico circular cerrado

covalentemente de ADN plasmídico circular abierto y/o de ARN mediante 5 cromatografía líquida a pH 6,5-8,5 que comprende las etapas de

(a) someter una mezcla de moléculas de ácido nucleico a una matriz de una superficie portadora a la que se ha anclado un ligando S-arilo seleccionado del grupo que consiste en piridino-2-tiol; piridin-2-ilmetanotiol; 2-piridin-2-iletanotiol; bencenotiol; pentafluorobencenotiol; hidrosulfuro de bencilo; 2,4difluorobencenotiol; hidroxi(4-mercaptofenil)oxoamonio; 4-(metiltio)bencenotiol; y 4-metoxibencenotiol para unir el ADN plasmídico circular cerrado, mientras el ADN plasmídico circular abierto y/o el ARN no se unen a una conductividad superior a 220 mS/cm;

15 (b) eluir el ADN plasmídico circular cerrado covalentemente aplicando un gradiente de conductividad decreciente; y

(c) opcionalmente lavar el portador con una solución adecuada;

donde las moléculas de ácido nucleico comprenden ADN plasmídico circular abierto 20 (oc), ADN plasmídico circular cerrado covalentemente (ccc), ADN genómico, y ARN.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una primera etapa de disgregación de las células, en las que se expresan las moléculas de ácido nucleico, para proporcionar la solución que comprende las moléculas de ácido

25 nucleico, cuya disgregación es una lisis.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una etapa adicional de elución de las moléculas de ácido nucleico poniéndolas en contacto con un eluyente adecuado.

4. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el portador es una matriz inorgánica.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, donde el portador es 35 un vidrio.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, donde el portador es zeolita.

7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, donde el portador es 5 sílice.

8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el portador es una matriz orgánica.

10 9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, donde el portador es una resina o polímero.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, donde el portador es

agarosa o agarosa entrecruzada, dextrano, poliestireno/divinilbenceno, poliestireno 15 revestido, polímero acrílico, polímero acrílico con dextrano, polímero injertado vinílico,

o polímero vinílico.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, donde el portador son

diferentes resinas a base de sílice en forma de sílice-dextrano, sílice-polímero acrílico 20 o sílice-polietilenimina.

12. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, donde el portador está presente como superficie activa a la cual se somete la mezcla de moléculas de ácido nucleico.

13. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, donde el portador está presente como una membrana que se pone en contacto con la mezcla de moléculas de ácido nucleico.

30 14. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, donde el portador está presente en forma de un coadyuvante de filtración que se pone en contacto con la mezcla de moléculas de ácido nucleico.

15. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 35 precedentes, donde el portador está presente en forma de matriz cromatográfica en una columna a través de la cual se hace pasar la mezcla de moléculas de ácido nucleico.

16. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones precedentes, donde el portador está presente como un material esponjoso al cual se somete la mezcla de moléculas de ácido nucleico.

17. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1-16,

donde el ligando S-arilo es un ligando piridil-S que tiene el radical S unido a la posición 10 2 (orto) con respecto al átomo de nitrógeno del piridilo.

18. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1-16, donde el ligando S-arilo es un ligando piridil-S que tiene el radical S unido a la posición 3 (meta) con respecto al átomo de nitrógeno del piridilo.

19. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, donde el ligando Sarilo es un ligando piridil-S que tiene el radical S unido a la posición 2 (orto) con respecto al átomo de nitrógeno del piridilo y separado del radical piridilo por medio de una cadena de alquileno que tiene de 1 a 7 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 4

20 átomos de carbono.

20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, donde el ligando Sarilo es un ligando piridil-S que tiene el radical S unido a la posición 3 (meta) con respecto al átomo de nitrógeno del piridilo y separado del radical piridilo por medio de

25 una cadena de alquileno que tiene de 1 a 7 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 4 átomos de carbono.

21. Un procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1-16, donde el ligando S-arilo es un ligando fenil-S.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, donde el ligando Sarilo es un ligando fenil-S que tiene el radical fenilo separado del radical S por medio de una cadena de alquileno que tiene de 1 a 7 átomos de carbono, preferiblemente 1 a 4 átomos de carbono.