Un método forense que comprende los pasos de: (i) determinar una primera masa molecular de un primer producto de amplificación de un Cebador amplicón identificador de ADN mitocondrial por espectrometría de masas;

y (ii) comparar la primera masa molecular con una segunda masa molecular de un segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial, donde el Cebador y el segundo amplicones identificadores de ADN mitocondrial contienen las mismas secuencias conservadas para la hibridación del mismo par de cebadores, donde el método no comprende la secuenciación de ácido nucleico del primer producto de amplificación, y donde la segunda masa molecular del segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial está indexado a un sujeto y contenido en una base de datos

CAMPO DE LA INVENCION

Esta invención se refiere al campo del análisis de ADN mitocondrial. La invención permite la identificación rápida y precisa de organismos eucariotas e individuales por métodos forenses así como la caracterización de la heteroplasmia del ADN mitocondrial y la predicción del comienzo de enfermedades mitocondriales. ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El ADN mitocondrial (ADNmt) se encuentra en eucariotas y se diferencia del ADN nuclear en su localización, su secuencia, su cantidad en la célula, y su modo de herencia. El núcleo de la célula contiene dos juegos de 23 cromosomas, un juego paternal y un juego maternal. Sin embargo, las células pueden contener de cientos a miles de mitocondrias, cada una de las cuales puede contener varias copias de ADNmt. El ADN nuclear tiene muchas más bases que el ADNmt, pero el ADNmt está presente en muchas más copias que el ADN nuclear. Esta característica del ADNmt es útil en situaciones donde la cantidad de ADN en una muestra es muy limitada. Fuentes típicas de ADN recuperadas de escenas de un crimen incluyen pelo, huesos, dientes, y fluidos corporales como saliva, semen y sangre.

En los humanos, el ADN mitocondrial es heredado estrictamente de la madre (Case J. T. y Wallace, D.C. Somatic Cell Genetics, 1981, 7, 103-1089; Giles, R. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1980, 77, 6715-6719; Hutchison, C.A. et al. Nature, 1974, 251, 536-538). Por lo tanto, las secuencias de ADNmt obtenidas de individuos relacionados maternalmente, como un hermano y una hermana o una madre y una hija, coincidirán exactamente entre ellos en ausencia de una mutación. Esta característica del ADNmt es ventajosa en casos de personas desaparecidas ya que se pueden proporcionar muestras de ADNmt de referencia por cualquier pariente maternal del individuo desaparecido (Ginther, C. et al. Nature Genetics, 1992, 2, 135138; Holland, M. M. et al. Journal of Forensic Sciences, 1993, 38, 542-553; Stoneking, M. et al. American Journal of Human Genetics, 1991, 48, 370-382).

El genoma del ADNmt humano es aproximadamente de

16.569 bases en longitud y tiene dos regiones generales; la región codificante y la región de control. La región codificante es responsable de la producción de varias moléculas biológicas involucradas en el proceso de producción de energía en la célula. La región de control es responsable de la regulación de la molécula de ADNmt. Se ha descubierto que dos regiones del ADNmt dentro de la región de control son altamente polimórficas,

o variables, dentro de la población humana (Greenberg, B. D. et al. Gene, 1983, 21, 33-49). Estas dos regiones son denominadas “Región hipervariable I” (HVR1), que tiene un longitud aproximada de 342 pares de bases (bp), y “Región hipervariable II” (HVR2), que tiene una longitud aproximada de 268 bp. Los exámenes de ADNmt forenses se realizan utilizando estas dos regiones por el alto grado de variabilidad encontrado entre los individuos.

En Gabriel et al., Journal of Forensic Sciences, volumen 46, número 2, páginas 247 – 253, se informa de un enfoque mejorado del análisis de ADNmt forense, introduciendo las regiones hipervariables 1 y 2 (HV1/HV2) utilizando así una estrategia de amplificación de “conjunto de mini-cebadores” (MPS), consistiendo la última de cuatro productos de superposición que abarcan cada una de las regiones HV y oscilan de 126 a 170 bp, con un tamaño medio de 141 bp. Las secuencias de las muestras probadas se identifican por secuenciación por ciclos.

Aproximadamente 610 bp del ADNmt están actualmente secuenciados en el análisis ADNmt forense. El registro u la comparación de secuencias de ADNmt sería difícil y potencialmente confuso si se enumerasen todas las bases. Por lo tanto, la información de la secuencia de ADNmt es registrada enumerando solamente las diferencias respecto a la secuencia de ADN de referencia. Por convención, las secuencias de ADNmt humano son descritas utilizando la Primera secuencia de ADNmt completa publicada como referencia (Anderson, S. et al., Nature, 1981, 290, 457-465). A esta secuencia se hace comúnmente referencia como secuencia Anderson. También se le llama la secuencia de referencia Cambridge o la secuencia Oxford. A cada par de base en esta secuencia se le asigna un número. Las desviaciones de esta secuencia de referencia se registran como el número de la posición demostrando una diferencia y una letra de designación de la base diferente. Por ejemplo, una transición de A a G en la Posición 263 sería registrada como 263 G. Si hay presentes deleciones o inserciones de bases en el ADNmt, estás diferencias también son indicadas.

En los Estados Unidos, hay siete laboratorios que actualmente realizan exámenes forenses de ADNmt: el Laboratorio del FBI; Laboratory Corporation of America (LabCorp) en Research Triangle Park, Carolina del Norte; Mytotiping Technologies en State College, Pennsylvania: el Bode Technology Group (BTG) en Springfield, Virginia; el Laboratorio de Identificación de ADN de las Fuerzas Armadas (AFDIL) en Rockville, Maryland; BioSynthesis, Inc. en Lewisville, Texas; y Reliagene en Nueva Orleans, Luisiana.

Los análisis de ADN mitocondrial de estos laboratorios han sido admitidos en procesos criminales en los siguientes estados desde Abril de 1999: Alabama, Arkansas, Florida, Indiana, Illinois, Maryland, Michigan, Nuevo México, Carolina del Norte, Pennsylvania, Carolina del Sur, Tennessee, Texas, y Washington. El ADN mitocondrial ha sido también admitido y usado en juicios en Australia, el Reino Unido, y varios otros países Europeos.

Desde 1996, el número de individuos que realizan análisis de ADN mitocondrial en el Laboratorio del FBI ha aumentado de 4 a 12, con más personal esperado en el futuro cercano. Se han completado más de 150 casos de ADN mitocondrial por el Laboratorio del FBI desde Marzo de 1999, y docenas esperan análisis. Están siendo impartidos cursos forenses por personal del Laboratorio del FBI y otros grupos para formar científicos forenses en los procesos e interpretación de la secuenciación de ADNmt. Más y más individuos están aprendiendo sobre el valor de la secuenciación del ADNmt para obtener información útil de muestras probatorias que son pequeñas, están degradadas, o ambas cosas. La secuenciación de ADN mitocondrial se está haciendo conocida no sólo como una herramienta excluyente sino también como una técnica complementaria para usar con otros procesos de identificación humana.

El análisis de ADN mitocondrial continuará siendo una herramienta de gran alcance para los agentes del orden en los próximos años mientras otras aplicaciones son desarrolladas, validadas, y aplicadas en la prueba forense.

Actualmente, el análisis forense de ADNmt es riguroso y laborioso. Actualmente, sólo se pueden realizar 1-2 casos por mes por analista. Se combinan varias técnicas de bilogía molecular para obtener una secuencia de ADNmt de una muestra. Los pasos del proceso de análisis de ADNmt incluyen primeramente el análisis visual, la preparación de la muestra, extracción del ADN, amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cuantificación de la postamplificación del ADN, secuenciación del ADN automática, y análisis de datos. Otro factor que complica el análisis forense del ADNmt es la aparición de la heteroplasmia donde la fuente de ADNmt en una célula dada es heterogénea debido a mutaciones en ADNmt individuales. Hay dos formas de heteroplasmia que se encuentran en el ADNmt. Heteroplasmia de secuencia (también conocida como heteroplasmia de punto) es la aparición de más de una base en una posición o posiciones particulares en la secuencia de ADNmt. La heteroplasmia de longitud es la aparición de más de una longitud de un tramo de la misma base en la secuencia de ADNmt como resultado de la inserción de residuos de nucleótido.

La heteroplasmia es un problema para los investigadores forenses ya que una muestra de una escena de un crimen puede diferir de una muestra de un sospechoso por un par de base y esta diferencia puede ser interpretada como prueba suficiente para eliminar a ese individuo como sospechoso. Las muestras de pelo de un solo individuo pueden contener mutaciones heteroplasmicas a concentraciones enormemente diferentes e incluso la raíz y el tallo de un solo pelo pueden diferir. Los métodos de detección actualmente disponibles para los biólogos moleculares no pueden detectar niveles bajos de heteroplasmia. Además, si está presente, la heteroplasmia de longitud afectará adversamente las series de secuenciación...

1. Un método forense que comprende los pasos de:

(i) determinar una primera masa molecular de un primer producto de amplificación de un Cebador amplicón identificador de ADN mitocondrial por espectrometría de masas; y

(ii) comparar la primera masa molecular con una segunda masa molecular de un segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial,

donde el Cebador y el segundo amplicones identificadores de ADN mitocondrial contienen las mismas secuencias conservadas para la hibridación del mismo par de cebadores, donde el método no comprende la secuenciación de ácido nucleico del primer producto de amplificación, y donde la segunda masa molecular del segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial está indexado a un sujeto y contenido en una base de datos.

2. Un método forense de la reivindicación 1 donde un primer distintivo de composición de base es determinado de la primera masa molecular del primer producto de amplificación y donde el primer distintivo de composición de base se compara con un segundo distintivo de composición de base determinado para el segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial, y donde el segundo distintivo de composición de base es indexado a un sujeto y contenido en una base de datos.

3. Un método de acuerdo a la reivindicación 1 para rastrear la localización geográfica de un sujeto, que comprende los pasos de:

(i) determinar una primera masa molecular de un primer producto de amplificación de un primer amplicón identificador de ADN mitocondrial de una muestra forense que contiene ADN mitocondrial obtenido de una localización geográfica por espectrometría de masas;

(ii) comparar la primera masa molecular con una segunda masa molecular de un segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial donde el primer y el segundo

amplicones identificadores de ADN mitocondrial, contienen las mismas secuencias conservadas para la hibridación del mismo para de cebadores,

donde una coincidencia entre la primera masa molecular y la segunda masa molecular indica al menos una presencia transitoria del sujeto en la localización geográfica.

4. Un método forense de análisis de ADN mitocondrial que comprende los pasos de:

(i) reaccionar un producto de amplificación de un primer amplicón identificador de ADN mitocondrial con enzimas de restricción para producir una pluralidad de fragmentos de restricción;

(ii) determinar las primeras masas moleculares de los miembros de la pluralidad de fragmentos de restricción por espectrometría de masas; y

(iii) comparar las primeras masas moleculares de los miembros de la pluralidad de fragmentos de restricción con las segundas masas moleculares de los fragmentos de restricción de un segundo amplicón identificador de ADN mitocondrial obtenido con enzimas de restricción.

donde el método no comprende la secuenciación del ácido nucleico del producto de la amplificación, y donde las segundas masas moleculares de los fragmentos de restricción están indexadas a un sujeto y contenidas en una base de datos.

5. Un método forense de la reivindicación 4 donde los enzimas de restricción son cualquier combinación de Rsal, Hpall, HpyCH4IV, Pacl y Eael.

6. Un método forense de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el amplicón identificador de ADN mitocondrial comprende una porción de una región hipervariable del ADN mitocondrial.

7. Un método forense de la reivindicación 6, donde la región hipervariable comprende HV1 o HV2.

8. Un método forense de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el sujeto es un animal.

9. Un método forense de la reivindicación 8 donde el

animal es un humano.

10. Un método forense de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el sujeto es un organismo eucariota no humano, un hongo, un parasito, o un protozoario.

11. Un método de caracterizar la heteroplasmia de una muestra de ADN mitocondrial que comprende los pasos de:

(i) determinar las masas moleculares de una pluralidad de productos de amplificación del ADN mitocondrial por espectrometría de masas; y

(ii) y determinar las cantidades relativas de la

pluralidad de productos de amplificación, caracterizando así la heteroplasmia, donde el método no comprende la secuenciación del acido nucleico de los productos de amplificación.

12. Un método de la reivindicación 11 donde una pluralidad de muestras de ADN mitocondrial son obtenidas de un individuo en diferentes puntos de toda la vida del individuo, por lo que la caracterización de la heteroplasmia indica la tasa de mutaciones ocurridas naturalmente en el ADN mitocondrial.

13. Un método de la reivindicación 12 comprendiendo además correlacionar la tasa de mutaciones ocurridas naturalmente en el ADN mitocondrial con la tasa de inicio de enfermedad mitocondrial en una pluralidad de individuos afectados por la enfermedad mitocondrial, donde la correlación proporciona un medio para predecir la tasa de inicio de la enfermedad mitocondrial.

14. El método de la reivindicación 13 donde la enfermedad mitocondrial es Enfermedad de Alpers, síndrome de Barth, Defectos de Beta-oxidación, Deficiencia de Carnitina-Acilcarnitina, Deficiencia de Carnitina, Deficiencia del Co-Enzima Q10, Deficiencia del Complejo I, Deficiencia del Complejo II, Deficiencia del Complejo III, Deficiencia del Complejo IV, Deficiencia del Complejo V, Deficiencia de COX, CPEO, Deficiencia de CPT I, Deficiencia de CPT II, Aciduria

glutárica Tipo II, KSS, Acidosis láctica, LCAD, LCHAD, Enfermedad o Síndrome de Leigh, LHON, Cardiomiopatía Infantil Letal, Enfermedad de Luft, MAD, MCA, MELAS, MERRF, Citopatía Mitocondrial, Agotamiento de ADN Mitocondrial, Encefalopatía Mitocondrial, Miopatía Mitocondrial, MNGIE, NARP, Síndrome de Pearson, Deficiencia de Piruvato Carboxilasa, Deficiencia de Piruvato Deshidrogenasa, Cadena Respiratoria, SCAD, SCHAD, o VLCAD.

15. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde la masa molecular de un producto de amplificación es determinada por espectrometría de masas ESI-FTICR.

16. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde la masa molecular de un producto de amplificación es determinada por espectrometría de masas ESI-TOF.

17. Un par de cebadores seleccionados del grupo consistente de:

(a) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:8 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 9;

(b) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:10 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:11;

(c) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 12 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 13;

(d) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:14 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:15;

(e) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:16 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:17;

(f) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 18 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:19;

(g) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:20 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:21;

(h) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:22 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:23;

(i) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:24 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:25;

(j) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:26 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:27;

(k) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:28 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:29;

(l) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:30 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:31;

(m) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:32 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 33;

(n) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:34 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 35;

(o) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 36 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO: 37;

(p) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:38 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:39;

(q) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:40 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:41; y

(r) un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos

5 consistente de SEQ ID NO:42 y un cebador que tiene una secuencia de nucleótidos consistente de SEQ ID NO:43;

18. El par de cebadores de la reivindicación 17 donde los cebadores comprenden al menos una base nitrogenada modificada.

10 19. El par de cebadores de la reivindicación 18 donde la mencionada base nitrogenada modificada es 5-propinilo-uridina o 5-propinilo-citidina.

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