Procedimiento para la rápida detección e identificación de bacterias.

Un procedimiento para identificar una bacteria desconocida que comprende:

a) poner en contacto un ácido nucleico que es una secuencia de un gen de dicha bacteria con al menos un par de cebadores oligonucleotídicos que hibridan con regiones de secuencia conservada de dicho ácido nucleico que muestran entre el 80% y el 100% de identidad entre diferentes especies de bacterias pero que no son específicos para un género de bacteria particular, en el que dichas regiones de secuencia flanquean una secuencia de ácido nucleico variable intermedia de la bacteria, y en el que hay una separación de entre 30 y 250 nucleótidos entre dichas regiones de secuencia;

b) amplificar dicha secuencia de ácido nucleico variable usando dicho al menos un par de cebadores oligonucleotídicos para producir un producto de amplificación;

c) determinar la masa molecular de dicho producto de amplificación por espectrometría de masas y determinar adicionalmente la composición de bases de dicho producto de amplificación; y

d) comparar dicha composición de bases con una o más composiciones de bases de productos de amplificación obtenidos realizando las etapas a)-c) sobre una pluralidad de bacterias conocidas, en el que dicha una o más composiciones de bases están contenidas en una base de datos de composiciones de bases distintivas, y en el que una coincidencia identifica dicha bacteria desconocida.

Procedimiento para la rápida detección e identificación de bacterias Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para la rápida detección e identificación de bacterias de muestras ambientales, clínicas u otras muestras. Los procedimientos proporcionan la detección y caracterización de una composición de bases distintiva (BCS del inglés "base composition signature") única de cualquier bacteria. La BCS única se usa para identificar rápidamente las bacterias.

Antecedentes de la invención La rápida y definitiva identificación microbiana es deseable por una diversidad de razones industriales, médicas, ambientales, de calidad, e investigación. Tradicionalmente, el laboratorio de microbiología ha funcionado identificando agentes etiológicos de enfermedades infecciosas a través del examen directo y el cultivo de muestras. Desde mediados de 1980, los investigadores han demostrado repetidamente la utilidad práctica de técnicas de biología molecular, muchas de las cuales forman la base de ensayos clínicos de diagnóstico. Algunas de estas técnicas incluyen análisis de hibridación de ácidos nucleicos, análisis con enzimas de restricción, análisis de secuencias genéticas, y separación y purificación de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) . Estos procedimientos, en general, llevan mucho tiempo y son tediosos. Otra opción es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otro procedimiento de amplificación que amplifique una secuencia de ADN diana específica basad en los cebadores flanqueantes usados. Finalmente, la detección y el análisis de los datos convierten en acontecimiento de hibridación en un resultado analítico.

Otras técnicas para la detección de bioagentes incluyen espectrometría de masas (EM) de alta resolución, EM de baja resolución, fluorescencia, radioyodación, chips de ADN y técnicas con anticuerpos. Ninguna de estas técnicas es completamente satisfactoria.

La espectrometría de masas proporciona información detallada acerca de las moléculas que se están analizando, incluyendo la elevada precisión másica. Es también un procedimiento que puede automatizarse fácilmente. Sin embargo, la EM de alta resolución sola no logra funcionar frente a agentes desconocidos o biodiseñados, o en entornos en los que hay un elevado nivel de fondo de bioagentes (fondo "lleno") . La EM de baja resolución puede no lograr detectar algunos agentes conocidos, si sus líneas espectrales son suficientemente débiles o suficientemente cercadas a las de otros organismos vivos en la muestra. Los chips de ADN con sondas específicas solamente pueden determinar la presencia o ausencia de organismos específicamente previstos. Como hay cientos de miles de especies de bacterias benignas, algunas muy similares en secuencia a organismos amenazadores, incuso las series con 10.000 sondas carecen de la amplitud necesaria para detectar un organismo particular.

Los anticuerpos afrontan limitaciones de diversidad más severas que las series. Si se diseñan anticuerpos contra dianas altamente conservadas para aumentar la diversidad, dominará el problema de falsa alarma, de nuevo porque organismos amenazantes son muy similares a los benignos. Los anticuerpos son capaces solamente de detectar agentes conocidos en entornos relativamente no llenos.

Varios grupos han descrito la detección de productos de PCR usando espectrometría de masas de alta resolución con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (EM IEN-TF-RCI) . La medición precisa de la masa exacta combinada con el conocimiento de la cantidad de al menos un nucleótido permitió el cálculo de la composición de bases total para productos de PCR dúplex de aproximadamente 100 pares de bases. (Aaserud y col., J. Am. Soc. Mass Spec. 7:1266-1269, 1996; Muddiman y col., Anal. Chem. 69:1543-1549, 1997; Wunschel y col., Anal. Chem. 70:1203-1207, 1998; Muddiman y col., Rev. Anal. Chem. 17:168, 1998) . La EM con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (IEN-TF-RCI) puede usarse para determinar la masa de productos de PCR bicatenarios, de 500 pares de bases mediante la masa molecular promedio (Hurst y col., Rapid Commun. Mass Spec. 10:377-382, 1996) . Se ha descrito el uso de espectrometría de masas por desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para la caracterización de productos de PCR. (Muddiman y col., Rapid Commun. Mass Spec. 13:12011204, 1999) . Sin embargo, la degradación de ADN de más de aproximadamente 75 nucleótidos observada con MALDI limitó la utilidad de este procedimiento.

La patente de Estados Unidos Nº 5.849.492 describe un procedimiento para la recuperación de secuencias de ADN filogenéticamente informativas que comprende la búsqueda de un segmento altamente divergente de ADN genómico rodeado por dos segmentos altamente conservados, el diseño de cebadores universales para la amplificación por PCR de la región altamente divergente, la amplificación del ADN genómico por la técnica de PCR usando cebadores universales, y después la secuenciación del gen para determinar la identidad del organismo.

La patente de Estados Unidos Nº 5.965.363 divulga procedimientos para explorar ácidos nucleicos para polimorfismos mediante el análisis de ácidos nucleicos diana amplificados usando técnicas espectrométricas de masas y procedimientos para mejorar la resolución de masas y la precisión de masas de estos procedimientos.

El documento WO 99/14375 describe procedimientos, cebadores de PCR y kits para su uso en el análisis de alelos repetidos de nucleótidos en tándem de ADN preseleccionados por espectrometría de masas.

El documento WO 98/12355 divulga procedimientos para determinar la masa de un ácido nucleico diana por análisis espectrométrico de masas, escindiendo el ácido nucleico diana para reducir su longitud, haciendo que la diana sea monocatenaria y usando EM para determinar la masa de la diana acortada monocatenaria. También se desvelan procedimientos para preparar un ácido nucleico diana bicatenario para análisis por EM que comprende la amplificación del ácido nucleico diana, la unión de una de las cadenas a un soporte sólido, la liberación de la segunda cadena y después la liberación de la primera cadena que después se analiza por EM. También se proporcionan kits para la preparación de ácido nucleico diana.

El documento PCT WO97/33000 divulga procedimientos para detectar mutaciones en un ácido nucleico diana por fragmentación no aleatoria de la diana en una serie de fragmentos monocatenarios de longitud no aleatoria y determinando sus masas por EM.

La patente de Estados Unidos Nº 5.605.798 describe un procedimiento rápido y altamente preciso basado en espectrometría de masas para detectar la presencia de un ácido nucleico particular en una muestra biológica para propósitos de diagnóstico.

El documento WO 98/21066 describe procedimiento para determinar la secuencia de un ácido nucleico diana particular por espectrometría de masas. Se desvelan procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra biológica por amplificación por PCR y detección por espectrometría de masas, así como procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra por amplificación de la diana con cebadores que contienen sitios de restricción y marcas, extendiendo y escindiendo el ácido nucleico amplificado, y detectando la presencia del producto extendido, donde la presencia de una fragmento de ADN de una masa diferente del tipo silvestre es indicativa de una mutación. También se describen procedimientos para secuenciar un ácido nucleico mediante procedimientos de espectrometría de masas.

Los documentos WO 97/37041, WO 99/31278 y la patente de Estados Unidos Nº 5.547.835 describen procedimientos para secuenciar ácidos nucleicos usando espectrometría de masas. Las patentes de Estados Unidos Nº 5.622.824, 5.872.003 y 5.691.141 describen procedimientos, sistemas y kits para secuenciación espectrométrica de masas mediada por exonucleasa.

Johnson y col. (J. Microbiol. Methods, 2000, Vol. 40, p. 241-254) describe la determinación del peso molecular preciso de productos de PCR de la región espaciadora intergénica de ARNr usando espectrometría de masas de cuadrupolo con electronebulización para la diferenciación de B. subtilis y B. atrophaeus, especies muy relacionadas de bacterias.

Hahner y col. (Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28 (18) , e82) describe el análisis de polimorfismos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para identificar una bacteria desconocida que comprende:

a) poner en contacto un ácido nucleico que es una secuencia de un gen de dicha bacteria con al menos un par de cebadores oligonucleotídicos que hibridan con regiones de secuencia conservada de dicho ácido nucleico que muestran entre el 80% y el 100% de identidad entre diferentes especies de bacterias pero que no son específicos para un género de bacteria particular, en el que dichas regiones de secuencia flanquean una secuencia de ácido nucleico variable intermedia de la bacteria, y en el que hay una separación de entre 30 y 250 nucleótidos entre dichas regiones de secuencia; b) amplificar dicha secuencia de ácido nucleico variable usando dicho al menos un par de cebadores oligonucleotídicos para producir un producto de amplificación; c) determinar la masa molecular de dicho producto de amplificación por espectrometría de masas y determinar adicionalmente la composición de bases de dicho producto de amplificación; y d) comparar dicha composición de bases con una o más composiciones de bases de productos de amplificación obtenidos realizando las etapas a) -c) sobre una pluralidad de bacterias conocidas, en el que dicha una o más composiciones de bases están contenidas en una base de datos de composiciones de bases distintivas, y en el que una coincidencia identifica dicha bacteria desconocida.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de amplificación comprende la reacción en cadena de la polimerasa.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de amplificación comprende la reacción en cadena de la ligasa o amplificación por desplazamiento de hebra.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho ácido nucleico es una secuencia génica de ARN ribosómico.

5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dichas regiones de secuencia conservada son regiones del ARNr 5S.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dichas regiones de secuencia conservada son regiones del ARNr 16S.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dichas regiones de secuencia conservada son regiones del ARNr 23S.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho ácido nucleico codifica una proteína implicada en la traducción, replicación, recombinación y reparación, transcripción, metabolismo de nucleótidos, metabolismo de aminoácidos, metabolismo de lípidos, generación de energía, captación o secreción.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho ácido nucleico codifica RNasa P o una ARN polimerasa dependiente de ARN.

10. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho producto de amplificación se ioniza antes de la determinación de la masa molecular.

11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente la etapa de aislar el ácido nucleico de dicha bacteria antes de poner en contacto dicho ácido nucleico con dicho al menos un par de cebadores oligonucleotídicos.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente la etapa de realizar las etapas a) -d) usando un par diferente de cebadores oligonucleotídicos y comparar los resultados con una o más composiciones de bases obtenidas realizando las etapas a) -c) sobre una pluralidad de organismos conocidos diferentes de los de la etapa d) .

13. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que la etapa c) no incluye secuenciación de ácido nucleico de la secuencia diana amplificada.

14. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho producto de amplificación se ioniza por ionización por electronebulización, desorción láser asistida por matriz o bombardeo de átomos rápidos.

15. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha espectrometría de masas se selecciona entre el grupo que consiste en espectrometría de masas por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (TFRCI-EM) , retención de iones, cuadrupolo, sector magnético, tiempo de vuelo (TOF) , Q-TOF y triple cuadrupolo.

16. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, que comprende adicionalmente realizar la etapa b) en presencia de una análogo de adenosina, timidina, guanosina o citidina que tiene un peso molecular diferente de la adenosina, timidina, guanosina o citidina.

17. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho cebador oligonucleotídico comprende un análogo de base en las posiciones 1 y 2 de cada triplete dentro de dicho cebador, en el que dicho análogo de base se une con afinidad aumentada a su complemento en comparación con la base nativa.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho análogo de base se selecciona entre el grupo que consiste en 2, 6-diaminopurina, propina T, propina G, fenoxazinas y pinza G.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha base cebadora comprende una base universal en la posición 3 de cada triplete dentro de dicho cebador.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicha base universal se selecciona entre el grupo que consiste en inosina, guanidina, uridina, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, dP, dK, y 1- (2-desoxi-P-1-ribofuranosil) -imidazol-4carboxamida.

21. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha secuencia de ácido nucleico variable intermedia muestra no más de aproximadamente el 5% de identidad entre especies bacterianas.

22. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dichas regiones de secuencia están separadas por no más de aproximadament.

5. 250 nucleótidos.

23. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dichas regiones de secuencia están separadas por no más de aproximadament.

6. 100 nucleótidos.

24. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha bacteria es un miembro del género

Acinetobacter, Aeromonas, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Chlamydophila, Clostridium, Coxiella, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Legionella, Leptospira, Listeria, Moxarella, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Proteus, Pseudomonas, Rhodobacter, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptobacillus, Streptomyces, Treponema, Ureaplasma, Vibrio o Yersinia.

25. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha bacteria se identifica a nivel de especie.

26. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha bacteria se identifica a nivel de cepa.

27. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que dicha bacteria es un agente de guerra biológica.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en el que dicho agente de guerra biológica es Bacillus anthracis, Yersinia pestis, Franciscella tularensis, Brucella suis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomalleii, Salmonella typhi, Rickettsia typhii, Rickettsia prowasekii, Coxiella burnetii, Rhodobacter capsulatus, Chlamydia pneumoniae, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Coxiella burnetti, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, o Vibrio cholerae.