Procedimiento para la identificación y detección rápida de bioagentes.

Un procedimiento para identificar un bioagente desconocido que comprende:

a) poner en contacto el ácido nucleico del bioagente con al menos un par de cebadores de oligonucleótidosque hibridizan a las secuencias conservadas del ácido nucleico y flanquean una secuencia de ácidosnucleicos variable;

b) amplificar la secuencia de ácidos nucleicos variable usando el mencionado al menos un par de cebadoresde oligonucleótidos para producir un producto de la amplificación;

c) determinar la masa molecular del mencionado producto de la amplificación por espectrometría de masas ydeterminar la composición base del mencionado producto de la amplificación; y

d) comparar la mencionada composición base con una o más composiciones base de productos de laamplificación obtenidos realizando los pasos (a)-(c) en una pluralidad de organismos conocidos en donde lasmencionadas una o más composiciones base están contenidas en una base de datos, y en donde unacoincidencia identifica el bioagente desconocido.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a procedimientos para la detección e identificación rápida de bioagentes de muestras ambientales, clínicas u otras. Los procedimientos proporcionan la detección y caracterización de una composición de base distintiva (BCS) única de cualquier bioagente, incluyendo bacterias y virus. La BCS única se usa para identificar rápidamente el bioagente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rápida y definitiva identificación microbiana es deseable por una diversidad de razones industriales, médicas, ambientales, de calidad, e investigación. Tradicionalmente, el laboratorio de microbiología ha funcionado identificando agentes etiológicos de enfermedades infecciosas a través del examen directo y el cultivo de muestras. Desde mediados de 1980, los investigadores han demostrado repetidamente la utilidad práctica de técnicas de biología molecular, muchas de las cuales forman la base de ensayos clínicos de diagnóstico. Algunas de estas técnicas incluyen análisis de hibridación de ácidos nucleicos, análisis con enzimas de restricción, análisis de secuencias genéticas, y separación y purificación de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) . Estos procedimientos, en general, llevan mucho tiempo y son tediosos. Otra opción es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otro procedimiento de amplificación que amplifique una secuencia de ADN diana específica basad en los cebadores flanqueantes usados. Finalmente, la detección y el análisis de los datos convierten en acontecimiento de hibridación en un resultado analítico.

Otras técnicas para la detección de bioagentes incluyen espectrometría de masas (EM) de alta resolución, EM de baja resolución, fluorescencia, radioyodación, chips de ADN y técnicas con anticuerpos. Ninguna de estas técnicas es completamente satisfactoria.

La espectrometría de masas proporciona información detallada acerca de las moléculas que se están analizando, incluyendo la elevada precisión másica. Es también un procedimiento que puede automatizarse fácilmente. Sin embargo, la EM de alta resolución sola no logra funcionar frente a agentes desconocidos o biodiseñados, o en entornos en los que hay un elevado nivel de fondo de bioagentes (fondo "lleno") . La EM de baja resolución puede no lograr detectar algunos agentes conocidos, si sus líneas espectrales son suficientemente débiles o suficientemente cercadas a las de otros organismos vivos en la muestra. Los chips de ADN con sondas específicas solamente pueden determinar la presencia o ausencia de organismos específicamente previstos. Como hay cientos de miles de especies de bacterias benignas, algunas muy similares en secuencia a organismos amenazadores, incuso las series con 10.000 sondas carecen de la amplitud necesaria para detectar un organismo particular.

Los anticuerpos afrontan limitaciones de diversidad más severas que las series. Si se diseñan anticuerpos contra dianas altamente conservadas para aumentar la diversidad, dominará el problema de falsa alarma, de nuevo porque organismos amenazantes son muy similares a los benignos. Los anticuerpos son capaces solamente de detectar agentes conocidos en entornos relativamente no llenos.

Varios grupos han descrito la detección de productos de PCR usando espectrometría de masas de alta resolución con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (EM IEN-TF-RCI) . La medición precisa de la masa exacta combinada con el conocimiento de la cantidad de al menos un nucleótido permitió el cálculo de la composición de bases total para productos de PCR dúplex de aproximadamente 100 pares de bases. (Aaserud y col., J. Am. Soc. Mass Spec. 7:1266-1269, 1996; Muddiman y col., Anal. Chem. 69:1543-1549, 1997; Wunschel y col., Anal. Chem. 70:1203-1207, 1998; Muddiman y col., Rev. Anal. Chem. 17:1-68, 1998) . La EM con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (IEN-TF-RCI) puede usarse para determinar la masa de productos de PCR bicatenarios, de 500 pares de bases mediante la masa molecular promedio (Hurst y col., Rapid Commun. Mass Spec. 10:377-382, 1996) . Se ha descrito el uso de espectrometría de masas por desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para la caracterización de productos de PCR. (Muddiman y col., Rapid Commun. Mass Spec. 13:1201-1204, 1999) . Sin embargo, la degradación de ADN de más de aproximadamente 75 nucleótidos observada con MALDI limitó la utilidad de este procedimiento.

La patente de Estados Unidos Nº 5.849.492 describe un procedimiento para la recuperación de secuencias de ADN filogenéticamente informativas que comprende la búsqueda de un segmento altamente divergente de ADN genómico rodeado por dos segmentos altamente conservados, el diseño de cebadores universales para la amplificación por PCR de la región altamente divergente, la amplificación del ADN genómico por la técnica de PCR usando cebadores universales, y después la secuenciación del gen para determinar la identidad del organismo.

La patente de Estados Unidos Nº 5.965.363 divulga procedimientos para explorar ácidos nucleicos para polimorfismos mediante el análisis de ácidos nucleicos diana amplificados usando técnicas espectrométricas de masas y procedimientos para mejorar la resolución de masas y la precisión de masas de estos procedimientos.

El documento WO 99/14375 describe procedimientos, cebadores de PCR y kits para su uso en el análisis de alelos repetidos de nucleótidos en tándem de ADN preseleccionados por espectrometría de masas.

El documento WO 98/12355 divulga procedimientos para determinar la masa de un ácido nucleico diana por análisis espectrométrico de masas, escindiendo el ácido nucleico diana para reducir su longitud, haciendo que la diana sea monocatenaria y usando EM para determinar la masa de la diana acortada monocatenaria. También se desvelan procedimientos para preparar un ácido nucleico diana bicatenario para análisis por EM que comprende la amplificación del ácido nucleico diana, la unión de una de las cadenas a un soporte sólido, la liberación de la segunda cadena y después la liberación de la primera cadena que después se analiza por EM. También se proporcionan kits para la preparación de ácido nucleico diana.

El documento PCT WO97/33000 divulga procedimientos para detectar mutaciones en un ácido nucleico diana por fragmentación no aleatoria de la diana en una serie de fragmentos monocatenarios de longitud no aleatoria y determinando sus masas por EM.

La patente de Estados Unidos Nº 5.605.798 describe un procedimiento rápido y altamente preciso basado en espectrometría de masas para detectar la presencia de un ácido nucleico particular en una muestra biológica para propósitos de diagnóstico.

El documento WO 98/21066 describe procedimiento para determinar la secuencia de un ácido nucleico diana particular por espectrometría de masas. Se desvelan procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra biológica por amplificación por PCR y detección por espectrometría de masas, así como procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra por amplificación de la diana con cebadores que contienen sitios de restricción y marcas, extendiendo y escindiendo el ácido nucleico amplificado, y detectando la presencia del producto extendido, donde la presencia de una fragmento de ADN de una masa diferente del tipo silvestre es indicativa de una mutación. También se describen procedimientos para secuenciar un ácido nucleico mediante procedimientos de espectrometría de masas.

Los documentos WO 97/37041, WO 99/31278 y la patente de Estados Unidos Nº 5.547.835 describen procedimientos para secuenciar ácidos nucleicos usando espectrometría de masas. Las patentes de Estados Unidos Nº 5.622.824, 5.872.003 y 5.691.141 describen procedimientos, sistemas y kits para secuenciación espectrométrica de masas mediada por exonucleasa.

Johnson y col. (J. Microbiol. Methods, 2000, Vol. 40, p. 241-254) describe la determinación del peso molecular preciso de productos PCR de la región espaciadora intergénica del ARNr usando espectrometría de masas de cuadrupolo por electronebulización para la diferenciación de la B. subtilis y la B. atrophaeus, especies estrechamente relacionadas de bacterias.

Muddiman y col. (Analytical Chemistr y , 1996, Vol. 68, Nº 21, p. 3705-3712) describe la caracterización de productos de PCR de Bacilli usando espectrometría... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para identificar un bioagente desconocido que comprende:

a) poner en contacto el ácido nucleico del bioagente con al menos un par de cebadores de oligonucleótidos que hibridizan a las secuencias conservadas del ácido nucleico y flanquean una secuencia de ácidos nucleicos variable; b) amplificar la secuencia de ácidos nucleicos variable usando el mencionado al menos un par de cebadores de oligonucleótidos para producir un producto de la amplificación; c) determinar la masa molecular del mencionado producto de la amplificación por espectrometría de masas y determinar la composición base del mencionado producto de la amplificación; y d) comparar la mencionada composición base con una o más composiciones base de productos de la amplificación obtenidos realizando los pasos (a) - (c) en una pluralidad de organismos conocidos en donde las mencionadas una o más composiciones base están contenidas en una base de datos, y en donde una coincidencia identifica el bioagente desconocido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado bioagente es un virus.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en donde el mencionado virus es un virus ARN.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el mencionado virus ARN:

(i) es un virus ARN de cadena negativa seleccionado de arenavirus, Bunyavirus y Mononegavirales; o

(ii) es un virus ARN de cadena positiva seleccionado de Picornavirus, Astrovirus, Calcivirus, Nidovirales, Flavivirus y Togavirus.

5. El procedimiento de la reivindicación 2, en donde el mencionado virus es el virus de la viruela.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado bioagente es un hongo.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en donde el mencionado hongo es Coccidioides immitis.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado bioagente es un gen de toxina.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde la mencionada toxina es seleccionada de botulismo, micotoxinas T-2, ricina, enterotoxina B de estafilococo, shigatoxina, abrina, la aflatoxina, toxina épsilon de Clostridium perfringens, conotoxinas, diacetoxiscirpenol, tetrodotoxina y saxitoxina.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado bioagente es una espora.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el procedimiento se usa para la identificación de un bioagente desconocido en una muestra ambiental, y opcionalmente una muestra de agua.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el procedimiento se usa para la identificación de un bioagente desconocido en una muestra clínica, y opcionalmente una muestra clínica humana.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el mencionado paso de amplificación comprende reacción en cadena de polimerasa.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde el mencionado paso de amplificación comprende reacción en cadena de la ligasa o amplificación de desplazamiento de la cadena.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde las mencionadas secuencias a las que hibridizan al menos un par de cebadores de oligonucleótidos están altamente conservadas entre las diferentes especies de bioagentes.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde las mencionadas secuencias a las que hibridizan al menos un par de cebadores de oligonucleótidos están altamente conservadas entre los múltiples géneros de bioagentes diferentes.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado ácido nucleico es ARN ribosómico, o codifica RNasa P o codifica una polimerasa de ARN dependiente del ARN.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en donde el mencionado producto de la amplificación es ionizado antes de la determinación de la masa molecular, en donde la mencionada ionización es opcionalmente por ionización por electrospray, desorción por laser asistida por matriz o bombardeo con átomos rápidos.

19. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, comprendiendo además el paso de aislar el ácido nucleico del mencionado bioagente antes de poner en contacto el mencionado ácido nucleico con el mencionado al menos un par de cebadores del oligonucleótido.

20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde la mencionada espectrometría de masas es seleccionada del grupo consistente de espectrometría de masas de resonancia de ciclotrón de iones transformada de Fourier (FT-ICR-MS) , trampa de iones, cuadrupolo, sector magnético, tiempo de vuelo (TOF) , Q-TOF y triple cuadrupolo.

21. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, comprendiendo además realizar el paso b) en presencia de un análogo de adenina, timidina, guanosina o citidina que tienen un peso molecular diferente que la adenina, timidina, guanosina o citidina.

22. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde el mencionado cebador del oligonucleótido comprende un análogo de base en las posiciones 1 y 2 de cada triplete dentro del mencionado cebador, en donde el mencionado análogo de base enlaza con afinidad aumentada con su complemento en comparación con la base nativa, y/o en donde el mencionado cebador comprende opcionalmente una base universal en la posición 3 de cada triplete dentro del mencionado cebador.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en donde el mencionado análogo de base es seleccionado del grupo consistente de 2, 6-diaminopurina, propino T, propino G, fenoxazinas y abrazadera G, y/o en donde la mencionada base universal es seleccionada del grupo consistente de inosina, uridina guanidina, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, dP, dK, y 1- (2-desoxi-β-D-ribofuranosil) -imidazol-4-carboxamida.