Secuenciación de ADN.

Un método para secuenciar un ácido nucleico objetivo usando un enfoque de secuenciación por síntesis (SBS),

el método comprendiendo:

a) proporcionar una primera pluralidad de una primera base de nucleótidos, una segunda pluralidad de una segunda base de nucleótidos, una tercera pluralidad de una tercera base de nucleótidos, y una cuarta pluralidad de una cuarta base de nucleótidos, en donde:

(1) una primera proporción de una primera porción de la primera pluralidad marcada con un primer marcador en relación a una segunda porción de la primera pluralidad marcada con un segundo marcador; y

(2) una segunda proporción de una tercera porción de la segunda pluralidad marcada con el primer marcador en relación con una cuarta porción de la segunda pluralidad marcada con el segundo marcador,

(3) una tercera proporción de una quinta porción de la tercera pluralidad marcada con el primer marcador en relación a la sexta porción de la tercera pluralidad marcada con el segundo marcador; y

(4) una cuarta proporción de una séptima porción de la cuarta pluralidad marcada con el primer marcador en relación con una octava porción de la cuarta pluralidad marcada con el segundo marcador, son todas detectablemente diferentes entre sí;

b) incorporar mediante polimerización la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos, la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos, la tercera pluralidad de la tercera base de nucleótidos, o la cuarta pluralidad de la cuarta base de nucleótidos en una pluralidad de copias de un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico objetivo;

c) determinar una proporción de señales producida de la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos o una proporción de señales producida de la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos o una señal producida de la tercera pluralidad de la tercera base de nucleótidos o una señal producida de la cuarta pluralidad de la cuarta base de nucleótidos en la pluralidad de copias de un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico objetivo,

en donde una primera proporción de señales producida por la primera pluralidad de la primera base de nucleótidos, una segunda proporción de señales producida por la segunda pluralidad de la segunda base de nucleótidos, una tercera proporción de señales producida por la tercera pluralidad de la tercera base de nucleótidos, y una cuarta proporción de señales producida por la cuarta pluralidad de la cuarta base de nucleótidos son todas detectablemente diferentes y en donde las proporciones de señales producidas de la primera pluralidad, la segunda pluralidad, la tercera pluralidad y la cuarta pluralidad se producen cada una por al menos dos marcadores que emites en dos longitudes de onda distinguibles;

d) asociar la proporción de señales con la primera base de nucleótidos o la segunda base de nucleótidos o la tercera base de nucleótidos o la cuarta base de nucleótidos para identificar la base de nucleótidos en la pluralidad de copias de un ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico objetivo; y

e) analizar un conjunto de datos de proporciones de señales ordenador para producir una secuencia de nucleótidos del ácido nucleico objetivo,

en donde el método de SBS es un enfoque de secuenciación basado en conjuntos la secuencia del ácido nucleico objetivo se determina detectando la señal producida después de cada incorporación de bases, y en donde:

(i) cada uno de los nucleótidos comprende un grupo 3' hidroxilo que está bloqueado químicamente y los cuatro nucleótidos se añaden simultáneamente a una reacción que comprende ADN polimerasa y agrupaciones de complejos plantilla-cebador; o

(ii) cada nucleótido se añade uno a la vez a una mezcla de la reacción que contiene un complejo ácido nucleico objetivo-cebador y una polimerasa.