Procedimiento para la detección e identificación rápida de bioagentes.

Un procedimiento para identificar un bioagente desconocido que comprende:

a) alinear una pluralidad de secuencias de genes de ácidos nucleicos de organismos de identidad conocida;

b) analizar dicha pluralidad de secuencias para regiones de conservación y variación;

c) identificar una pluralidad de regiones variables que flanquean sitios que enlazan con cebadores para cebar y obtener una o más regiones amplificables dentro de dicha pluralidad de secuencias;

d) identificar las composiciones base de dichas una o más regiones amplificables para miembros de dicha pluralidad de organismos conocidos para obtener una pluralidad de composiciones base de regiones amplificables indexadas a la identidad de uno o más miembros de dicha pluralidad de organismos de identidad conocida;

e) preparar una base de datos que contiene dichas composiciones base e identidades indexadas de miembros de dicha pluralidad de organismos obtenidos en el paso d).

f) determinar una composición base de un ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido, poniendo en contacto el ácido nucleico con al menos un par de cebadores de oligonucleótidos que hibridizan a secuencias de las mencionadas una o más regiones amplificables, amplificando la secuencia de ácidos nucleicos variable para producir un producto de la amplificación, determinar la masa molecular de dicho producto de la amplificación por espectrometría de masas y determinar después la composición base del producto de la amplificación; y

g) identificar el mencionado bioagente desconocido comparando la mencionada composición base del mencionado ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido con la mencionada base de datos.

Procedimiento para la detección e identificación rápida de bioagentes.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a procedimientos para la detección e identificación rápida de bioagentes de muestras ambientales, clínicas u otras. Los procedimientos proporcionan la detección y caracterización de una composición de base distintiva (BCS) única de cualquier bioagente, incluyendo bacterias y virus. La BCS única se usa para identificar rápidamente el bioagente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rápida y definitiva identificación microbiana es deseable por una diversidad de razones industriales, médicas, ambientales, de calidad, e investigación. Tradicionalmente, el laboratorio de microbiología ha funcionado identificando agentes etiológicos de enfermedades infecciosas a través del examen directo y el cultivo de muestras. Desde mediados de 1980, los investigadores han demostrado repetidamente la utilidad práctica de técnicas de biología molecular, muchas de las cuales forman la base de ensayos clínicos de diagnóstico. Algunas de estas técnicas incluyen análisis de hibridación de ácidos nucleicos, análisis con enzimas de restricción, análisis de secuencias genéticas, y separación y purificación de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) . Estos procedimientos, en general, llevan mucho tiempo y son tediosos. Otra opción es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otro procedimiento de amplificación que amplifique una secuencia de ADN diana específica basad en los cebadores flanqueantes usados. Finalmente, la detección y el análisis de los datos convierten en acontecimiento de hibridación en un resultado analítico.

Otras técnicas para la detección de bioagentes incluyen espectrometría de masas (EM) de alta resolución, EM de baja resolución, fluorescencia, radioyodación, chips de ADN y técnicas con anticuerpos. Ninguna de estas técnicas es completamente satisfactoria.

La espectrometría de masas proporciona información detallada acerca de las moléculas que se están analizando, incluyendo la elevada precisión másica. Es también un procedimiento que puede automatizarse fácilmente. Sin embargo, la EM de alta resolución sola no logra funcionar frente a agentes desconocidos o biodiseñados, o en entornos en los que hay un elevado nivel de fondo de bioagentes (fondo "lleno") . La EM de baja resolución puede no lograr detectar algunos agentes conocidos, si sus líneas espectrales son suficientemente débiles o suficientemente cercadas a las de otros organismos vivos en la muestra. Los chips de ADN con sondas específicas solamente pueden determinar la presencia o ausencia de organismos específicamente previstos. Como hay cientos de miles de especies de bacterias benignas, algunas muy similares en secuencia a organismos amenazadores, incuso las series con 10.000 sondas carecen de la amplitud necesaria para detectar un organismo particular.

Los anticuerpos afrontan limitaciones de diversidad más severas que las series. Si se diseñan anticuerpos contra dianas altamente conservadas para aumentar la diversidad, dominará el problema de falsa alarma, de nuevo porque organismos amenazantes son muy similares a los benignos. Los anticuerpos son capaces solamente de detectar agentes conocidos en entornos relativamente no llenos.

Varios grupos han descrito la detección de productos de PCR usando espectrometría de masas de alta resolución con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (EM IEN- TF-RCI) . La medición precisa de la masa exacta combinada con el conocimiento de la cantidad de al menos un nucleótido permitió el cálculo de la composición de bases total para productos de PCR dúplex de aproximadamente 100 pares de bases. (Aaserud y col., J. Am. Soc. Mass Spec. 7:1266-1269, 1996; Muddiman y col., Anal. Chem. 69:1543-1549, 1997; Wunschel y col., Anal. Chem. 70:1203-1207, 1998; Muddiman y col., Rev. Anal. Chem. 17:1- 68, 1998) . La EM con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (IEN-TF-RCI) puede usarse para determinar la masa de productos de PCR bicatenarios, de 500 pares de bases mediante la masa molecular promedio (Hurst y col., Rapid Commun. Mass Spec. 10:377-382, 1996) . Se ha descrito el uso de espectrometría de masas por desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para la caracterización de productos de PCR. (Muddiman y col., Rapid Commun. Mass Spec. 13:1201-1204, 1999) . Sin embargo, la degradación de ADN de más de aproximadamente 75 nucleótidos observada con MALDI limitó la utilidad de este procedimiento.

Johnson y col. (J. Microbiol. Methods, 2000, Vol. 40, p. 241-254) describe la determinación del peso molecular preciso de productos peR de la región espaciadora intergénica del ARNr usando espectrometría de masas de cuadrupolo por electronebulización para la diferenciación de la B. subtilis y la B. atrophaeus, especies estrechamente relacionadas de bacterias.

La patente de Estados Unidos Nº 5.849.492 describe un procedimiento para la recuperación de secuencias de ADN filogenéticamente informativas que comprende la búsqueda de un segmento altamente divergente de ADN genómico rodeado por dos segmentos altamente conservados, el diseño de cebadores universales para la amplificación por PCR de la región altamente divergente, la amplificación del ADN genómico por la técnica de PCR usando cebadores universales, y después la secuenciación del gen para determinar la identidad del organismo.

La patente de Estados Unidos Nº 5.965.363 divulga procedimientos para explorar ácidos nucleicos para polimorfismos mediante el análisis de ácidos nucleicos diana amplificados usando técnicas espectrométricas de masas y procedimientos para mejorar la resolución de masas y la precisión de masas de estos procedimientos.

El documento WO 99/14375 describe procedimientos, cebadores de PCR y kits para su uso en el análisis de alelos repetidos de nucleótidos en tándem de ADN preseleccionados por espectrometría de masas.

El documento WO 98/12355 divulga procedimientos para determinar la masa de un ácido nucleico diana por análisis espectrométrico de masas, escindiendo el ácido nucleico diana para reducir su longitud, haciendo que la diana sea monocatenaria y usando EM para determinar la masa de la diana acortada monocatenaria. También se desvelan procedimientos para preparar un ácido nucleico diana bicatenario para análisis por EM que comprende la amplificación del ácido nucleico diana, la unión de una de las cadenas a un soporte sólido, la liberación de la segunda cadena y después la liberación de la primera cadena que después se analiza por EM. También se proporcionan kits para la preparación de ácido nucleico diana.

El documento PCT WO97/33000 divulga procedimientos para detectar mutaciones en un ácido nucleico diana por fragmentación no aleatoria de la diana en una serie de fragmentos monocatenarios de longitud no aleatoria y determinando sus masas por EM.

La patente de Estados Unidos Nº 5.605.798 describe un procedimiento rápido y altamente preciso basado en espectrometría de masas para detectar la presencia de un ácido nucleico particular en una muestra biológica para propósitos de diagnóstico.

El documento WO 98/21066 describe procedimiento para determinar la secuencia de un ácido nucleico diana particular por espectrometría de masas. Se desvelan procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra biológica por amplificación por PCR y detección por espectrometría de masas, así como procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra por amplificación de la diana con cebadores que contienen sitios de restricción y marcas, extendiendo y escindiendo el ácido nucleico amplificado, y detectando la presencia del producto extendido, donde la presencia de una fragmento de ADN de una masa diferente del tipo silvestre es indicativa de una mutación. También se describen procedimientos para secuenciar un ácido nucleico mediante procedimientos de espectrometría de masas.

Los documentos WO 97/37041, WO 99/31278 y la patente de Estados Unidos Nº 5.547.835 describen procedimientos para secuenciar ácidos nucleicos usando espectrometría de masas. Las patentes de Estados Unidos Nº 5.622.824, 5.872.003 y 5.691.141 describen procedimientos, sistemas y kits para secuenciación espectrométrica de masas mediada por exonucleasa.

Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento para la detección e... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para identificar un bioagente desconocido que comprende:

a) alinear una pluralidad de secuencias de genes de ácidos nucleicos de organismos de identidad conocida; b) analizar dicha pluralidad de secuencias para regiones de conservación y variación; c) identificar una pluralidad de regiones variables que flanquean sitios que enlazan con cebadores para cebar y obtener una o más regiones amplificables dentro de dicha pluralidad de secuencias; d) identificar las composiciones base de dichas una o más regiones amplificables para miembros de dicha pluralidad de organismos conocidos para obtener una pluralidad de composiciones base de regiones amplificables indexadas a la identidad de uno o más miembros de dicha pluralidad de organismos de identidad conocida; e) preparar una base de datos que contiene dichas composiciones base e identidades indexadas de miembros de dicha pluralidad de organismos obtenidos en el paso d) . f) determinar una composición base de un ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido, poniendo en contacto el ácido nucleico con al menos un par de cebadores de oligonucleótidos que hibridizan a secuencias de las mencionadas una o más regiones amplificables, amplificando la secuencia de ácidos nucleicos variable para producir un producto de la amplificación, determinar la masa molecular de dicho producto de la amplificación por espectrometría de masas y determinar después la composición base del producto de la amplificación; y g) identificar el mencionado bioagente desconocido comparando la mencionada composición base del mencionado ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido con la mencionada base de datos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el paso (d) comprende además calcular las masas moleculares de las mencionadas regiones amplificables e indexar dichas masas moleculares a las mencionadas identidades de miembros de la mencionada pluralidad de organismos.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado organismo es una bacteria, virus o patógeno microbiano.

4. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde las mencionadas secuencias de ácidos nucleicos comprenden al menos un gen que codifica el ARN ribosómico o al menos un gen que codifica al menos una proteína que participa en la traducción, replicación, recombinación y reparación, transcripción, metabolismo del nucleótido, metabolismo del aminoácido, metabolismo del lípido, generación de energía o secreción.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde el mencionado al menos un gen que codifica al menos una proteína codifica la polimerasa del ADN, la polimerasa del ARN, el factor de elongación Tu, la proteína de choque térmico groEL, la fosfoglicerato quinasa, la NADH deshidrogenasa, la ADN ligasa, la ADN topoisomerasa, o el factor de elongación G.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde los mencionados sitios que enlazan con los cebadores se conservan de un 80% a un 100% entre las mencionadas secuencias alineadas del paso a) .

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en donde la región interviniente entre los mencionados sitios que enlazan con los cebadores no tiene más de un 5% de identidad de secuencia entre las mencionadas secuencias alineadas del paso a) .

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde las mencionadas regiones amplificables son de entre 50 y 250 nucleótidos de longitud.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la mencionada identidad es un nombre del género, un nombre de especie, o un nombre de cepa.