Procedimiento para la detección e identificación rápida de bioagentes.

Un procedimiento para identificar un bioagente desconocido que comprende:



a) alinear una pluralidad de secuencias de genes de ácidos nucleicos de organismos de identidad conocida;

b) analizar dicha pluralidad de secuencias para regiones de conservación y variación;

c) identificar una pluralidad de regiones variables que flanquean sitios que enlazan con cebadores para cebar y obtener una o más regiones amplificables dentro de dicha pluralidad de secuencias;

d) identificar las composiciones base de dichas una o más regiones amplificables para miembros de dicha pluralidad de organismos conocidos para obtener una pluralidad de composiciones base de regiones amplificables indexadas a la identidad de uno o más miembros de dicha pluralidad de organismos de identidad conocida;

e) preparar una base de datos que contiene dichas composiciones base e identidades indexadas de miembros de dicha pluralidad de organismos obtenidos en el paso d).

f) determinar una composición base de un ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido, poniendo en contacto el ácido nucleico con al menos un par de cebadores de oligonucleótidos que hibridizan a secuencias de las mencionadas una o más regiones amplificables, amplificando la secuencia de ácidos nucleicos variable para producir un producto de la amplificación, determinar la masa molecular de dicho producto de la amplificación por espectrometría de masas y determinar después la composición base del producto de la amplificación; y

g) identificar el mencionado bioagente desconocido comparando la mencionada composición base del mencionado ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido con la mencionada base de datos.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10179789.

Solicitante: IBIS BIOSCIENCES, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 2251 Faraday Avenue, Suite 150 Carlsbad, CA 92008 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ECKER, DAVID J., MCNEIL, JOHN, SAMPATH,RANGARAJAN, GRIFFEY,RICHARD,H, HOFSTADLER,STEVEN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/02 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con ribosilo como radical sacárido.
  • C07K5/00 C07 […] › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos con hasta cuatro aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.
  • G01N27/62 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 27/00 Investigación o análisis de materiales mediante el empleo de medios eléctricos, electroquímicos o magnéticos (G01N 3/00 - G01N 25/00 tienen prioridad; medida o ensayo de variables eléctricas o magnéticas o de las propiedades eléctricas o magnéticas de los materiales G01R). › investigando la ionización del gas; investigando la descarga eléctrica, p. ej. la emisión catódica.
  • G01N33/53 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
  • G01N33/566 G01N 33/00 […] › utilizando un soporte específico o proteínas receptoras como reactivos para la formación de uniones por ligando.

PDF original: ES-2448770_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la detección e identificación rápida de bioagentes.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a procedimientos para la detección e identificación rápida de bioagentes de muestras ambientales, clínicas u otras. Los procedimientos proporcionan la detección y caracterización de una composición de base distintiva (BCS) única de cualquier bioagente, incluyendo bacterias y virus. La BCS única se usa para identificar rápidamente el bioagente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La rápida y definitiva identificación microbiana es deseable por una diversidad de razones industriales, médicas, ambientales, de calidad, e investigación. Tradicionalmente, el laboratorio de microbiología ha funcionado identificando agentes etiológicos de enfermedades infecciosas a través del examen directo y el cultivo de muestras. Desde mediados de 1980, los investigadores han demostrado repetidamente la utilidad práctica de técnicas de biología molecular, muchas de las cuales forman la base de ensayos clínicos de diagnóstico. Algunas de estas técnicas incluyen análisis de hibridación de ácidos nucleicos, análisis con enzimas de restricción, análisis de secuencias genéticas, y separación y purificación de ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laborator y Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) . Estos procedimientos, en general, llevan mucho tiempo y son tediosos. Otra opción es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otro procedimiento de amplificación que amplifique una secuencia de ADN diana específica basad en los cebadores flanqueantes usados. Finalmente, la detección y el análisis de los datos convierten en acontecimiento de hibridación en un resultado analítico.

Otras técnicas para la detección de bioagentes incluyen espectrometría de masas (EM) de alta resolución, EM de baja resolución, fluorescencia, radioyodación, chips de ADN y técnicas con anticuerpos. Ninguna de estas técnicas es completamente satisfactoria.

La espectrometría de masas proporciona información detallada acerca de las moléculas que se están analizando, incluyendo la elevada precisión másica. Es también un procedimiento que puede automatizarse fácilmente. Sin embargo, la EM de alta resolución sola no logra funcionar frente a agentes desconocidos o biodiseñados, o en entornos en los que hay un elevado nivel de fondo de bioagentes (fondo "lleno") . La EM de baja resolución puede no lograr detectar algunos agentes conocidos, si sus líneas espectrales son suficientemente débiles o suficientemente cercadas a las de otros organismos vivos en la muestra. Los chips de ADN con sondas específicas solamente pueden determinar la presencia o ausencia de organismos específicamente previstos. Como hay cientos de miles de especies de bacterias benignas, algunas muy similares en secuencia a organismos amenazadores, incuso las series con 10.000 sondas carecen de la amplitud necesaria para detectar un organismo particular.

Los anticuerpos afrontan limitaciones de diversidad más severas que las series. Si se diseñan anticuerpos contra dianas altamente conservadas para aumentar la diversidad, dominará el problema de falsa alarma, de nuevo porque organismos amenazantes son muy similares a los benignos. Los anticuerpos son capaces solamente de detectar agentes conocidos en entornos relativamente no llenos.

Varios grupos han descrito la detección de productos de PCR usando espectrometría de masas de alta resolución con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (EM IEN- TF-RCI) . La medición precisa de la masa exacta combinada con el conocimiento de la cantidad de al menos un nucleótido permitió el cálculo de la composición de bases total para productos de PCR dúplex de aproximadamente 100 pares de bases. (Aaserud y col., J. Am. Soc. Mass Spec. 7:1266-1269, 1996; Muddiman y col., Anal. Chem. 69:1543-1549, 1997; Wunschel y col., Anal. Chem. 70:1203-1207, 1998; Muddiman y col., Rev. Anal. Chem. 17:1- 68, 1998) . La EM con ionización por electronebulización y por resonancia de ciclotrones iónicos con transformada de Fourier (IEN-TF-RCI) puede usarse para determinar la masa de productos de PCR bicatenarios, de 500 pares de bases mediante la masa molecular promedio (Hurst y col., Rapid Commun. Mass Spec. 10:377-382, 1996) . Se ha descrito el uso de espectrometría de masas por desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para la caracterización de productos de PCR. (Muddiman y col., Rapid Commun. Mass Spec. 13:1201-1204, 1999) . Sin embargo, la degradación de ADN de más de aproximadamente 75 nucleótidos observada con MALDI limitó la utilidad de este procedimiento.

Johnson y col. (J. Microbiol. Methods, 2000, Vol. 40, p. 241-254) describe la determinación del peso molecular preciso de productos peR de la región espaciadora intergénica del ARNr usando espectrometría de masas de cuadrupolo por electronebulización para la diferenciación de la B. subtilis y la B. atrophaeus, especies estrechamente relacionadas de bacterias.

La patente de Estados Unidos Nº 5.849.492 describe un procedimiento para la recuperación de secuencias de ADN filogenéticamente informativas que comprende la búsqueda de un segmento altamente divergente de ADN genómico rodeado por dos segmentos altamente conservados, el diseño de cebadores universales para la amplificación por PCR de la región altamente divergente, la amplificación del ADN genómico por la técnica de PCR usando cebadores universales, y después la secuenciación del gen para determinar la identidad del organismo.

La patente de Estados Unidos Nº 5.965.363 divulga procedimientos para explorar ácidos nucleicos para polimorfismos mediante el análisis de ácidos nucleicos diana amplificados usando técnicas espectrométricas de masas y procedimientos para mejorar la resolución de masas y la precisión de masas de estos procedimientos.

El documento WO 99/14375 describe procedimientos, cebadores de PCR y kits para su uso en el análisis de alelos repetidos de nucleótidos en tándem de ADN preseleccionados por espectrometría de masas.

El documento WO 98/12355 divulga procedimientos para determinar la masa de un ácido nucleico diana por análisis espectrométrico de masas, escindiendo el ácido nucleico diana para reducir su longitud, haciendo que la diana sea monocatenaria y usando EM para determinar la masa de la diana acortada monocatenaria. También se desvelan procedimientos para preparar un ácido nucleico diana bicatenario para análisis por EM que comprende la amplificación del ácido nucleico diana, la unión de una de las cadenas a un soporte sólido, la liberación de la segunda cadena y después la liberación de la primera cadena que después se analiza por EM. También se proporcionan kits para la preparación de ácido nucleico diana.

El documento PCT WO97/33000 divulga procedimientos para detectar mutaciones en un ácido nucleico diana por fragmentación no aleatoria de la diana en una serie de fragmentos monocatenarios de longitud no aleatoria y determinando sus masas por EM.

La patente de Estados Unidos Nº 5.605.798 describe un procedimiento rápido y altamente preciso basado en espectrometría de masas para detectar la presencia de un ácido nucleico particular en una muestra biológica para propósitos de diagnóstico.

El documento WO 98/21066 describe procedimiento para determinar la secuencia de un ácido nucleico diana particular por espectrometría de masas. Se desvelan procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra biológica por amplificación por PCR y detección por espectrometría de masas, así como procedimientos para detectar un ácido nucleico diana en una muestra por amplificación de la diana con cebadores que contienen sitios de restricción y marcas, extendiendo y escindiendo el ácido nucleico amplificado, y detectando la presencia del producto extendido, donde la presencia de una fragmento de ADN de una masa diferente del tipo silvestre es indicativa de una mutación. También se describen procedimientos para secuenciar un ácido nucleico mediante procedimientos de espectrometría de masas.

Los documentos WO 97/37041, WO 99/31278 y la patente de Estados Unidos Nº 5.547.835 describen procedimientos para secuenciar ácidos nucleicos usando espectrometría de masas. Las patentes de Estados Unidos Nº 5.622.824, 5.872.003 y 5.691.141 describen procedimientos, sistemas y kits para secuenciación espectrométrica de masas mediada por exonucleasa.

Por tanto, existe la necesidad de un procedimiento para la detección e... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para identificar un bioagente desconocido que comprende:

a) alinear una pluralidad de secuencias de genes de ácidos nucleicos de organismos de identidad conocida; b) analizar dicha pluralidad de secuencias para regiones de conservación y variación; c) identificar una pluralidad de regiones variables que flanquean sitios que enlazan con cebadores para cebar y obtener una o más regiones amplificables dentro de dicha pluralidad de secuencias; d) identificar las composiciones base de dichas una o más regiones amplificables para miembros de dicha pluralidad de organismos conocidos para obtener una pluralidad de composiciones base de regiones amplificables indexadas a la identidad de uno o más miembros de dicha pluralidad de organismos de identidad conocida; e) preparar una base de datos que contiene dichas composiciones base e identidades indexadas de miembros de dicha pluralidad de organismos obtenidos en el paso d) . f) determinar una composición base de un ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido, poniendo en contacto el ácido nucleico con al menos un par de cebadores de oligonucleótidos que hibridizan a secuencias de las mencionadas una o más regiones amplificables, amplificando la secuencia de ácidos nucleicos variable para producir un producto de la amplificación, determinar la masa molecular de dicho producto de la amplificación por espectrometría de masas y determinar después la composición base del producto de la amplificación; y g) identificar el mencionado bioagente desconocido comparando la mencionada composición base del mencionado ácido nucleico del mencionado bioagente desconocido con la mencionada base de datos.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el paso (d) comprende además calcular las masas moleculares de las mencionadas regiones amplificables e indexar dichas masas moleculares a las mencionadas identidades de miembros de la mencionada pluralidad de organismos.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el mencionado organismo es una bacteria, virus o patógeno microbiano.

4. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde las mencionadas secuencias de ácidos nucleicos comprenden al menos un gen que codifica el ARN ribosómico o al menos un gen que codifica al menos una proteína que participa en la traducción, replicación, recombinación y reparación, transcripción, metabolismo del nucleótido, metabolismo del aminoácido, metabolismo del lípido, generación de energía o secreción.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en donde el mencionado al menos un gen que codifica al menos una proteína codifica la polimerasa del ADN, la polimerasa del ARN, el factor de elongación Tu, la proteína de choque térmico groEL, la fosfoglicerato quinasa, la NADH deshidrogenasa, la ADN ligasa, la ADN topoisomerasa, o el factor de elongación G.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde los mencionados sitios que enlazan con los cebadores se conservan de un 80% a un 100% entre las mencionadas secuencias alineadas del paso a) .

7. El procedimiento de la reivindicación 1 en donde la región interviniente entre los mencionados sitios que enlazan con los cebadores no tiene más de un 5% de identidad de secuencia entre las mencionadas secuencias alineadas del paso a) .

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde las mencionadas regiones amplificables son de entre 50 y 250 nucleótidos de longitud.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la mencionada identidad es un nombre del género, un nombre de especie, o un nombre de cepa.


 

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