Un método de análisis para la caracterización y la cuantificación de isómeros de disulfuro de fragmentos de anticuerpo que comprenden las etapas de:

(a) pretratar el fragmento de anticuerpo con un disolvente orgánico, (b) digerir el fragmento de anticuerpo pretratado con una proteasa en presencia de un disolvente orgánico y (c) analizar los fragmentos de la digestión con proteasa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a isómeros de disulfuro de proteínas recombinantes y a métodos analíticos para detectar los isómeros de disulfuro y formas oxidadas de metionilo de los anticuerpos. Más específicamente, se refiere a isómeros de disulfuro de un anticuerpo que tiene especificidad hacia determinantes antigénicos del factor de necrosis tumoral alfa humano (TNFα). La presente invención también se refiere a métodos analíticos para detectar los isómeros de disulfuro del anticuerpo de TNFα y formas oxidadas de metionilo de los anticuerpos de TNFα. La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden los isómeros y a usos terapéuticos del anticuerpo.

Antecedentes de la invención

En una molécula de anticuerpo, hay dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera tienen en su extremo N-terminal un dominio variable. Cada dominio variable está compuesto por cuatro regiones estructurales (FRs) que se alternan con tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs). Los residuos en los dominios variables están numerados convencionalmente según un sistema ideado por Kabat y otros. Este sistema se describe en Kabat y otros, 1987, en “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Departamento de Salud y de Servicios Humanos de EE.UU., NIH, EE.UU. (de aquí en adelante, “Kabat y otros (supra)”). Este sistema de numeración se emplea en la presente memoria descriptiva, a no ser que se indique de otro modo.

Las designaciones de los residuos según Kabat no se corresponden siempre directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que, en la numeración estricta de Kabat, se corresponden con un acortamiento o a una inserción de un componente estructural, tanto estructural como CDR, de la estructura básica del dominio variable. La numeración correcta de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado, mediante la alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo, con una secuencia numerada de Kabat “convencional”.

Las CDRs del dominio variable de la cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDRH1), los residuos 50-65 (CDRH2) y los residuos 95-102 (CDRH3), según la numeración de Kabat.

Las CDRs del dominio variable de la cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDRL1), los residuos 50-56 (CDRL2) y los residuos 89-97 (CDRL3), según la numeración de Kabat.

La construcción de anticuerpos injertados con CDR se describe en el documento de solicitud de patente europea EP-A-0239400, que describe un procedimiento en el cual las CDRs de un anticuerpo monoclonal de ratón se injertan en las regiones estructurales de los dominios variables de una inmunoglobulina humana, mediante mutagénesis dirigida al sitio, usando oligonucleótidos largos. Las CDRs determinan la especificidad de la unión con el antígeno de los anticuerpos y son secuencias peptídicas relativamente cortas que se encuentran en las regiones estructurales de los dominios variables.

El primer trabajo sobre anticuerpos monoclonales humanizados mediante el injerto de CDRs, se realizó con anticuerpos monoclonales que reconocían antígenos sintéticos, tales como NP.

Sin embargo, ejemplos en los cuales un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la lisozima y un anticuerpo monoclonal de rata que reconoce un antígeno en los linfocitos T humanos, que se humanizaron mediante el injerto de CDRs, han sido descritos por Verhoeyen y otros (Science, 239,1534-1536, 1988) y Riechmann y otros (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.

Riechmann y otros observaron que la transferencia solo de las CDRs (tal y como las definió Kabat (Kabat y otros (supra) y Wu y otros, J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) no era suficiente para proporcionar una actividad satisfactoria de unión al antígeno en el producto injertado con CDR. Se observó que una cantidad de residuos estructurales se tienen que alterar de modo que se correspondan a los de la región estructural del donante. Los criterios propuestos para seleccionar qué residuos estructurales se tienen que alterar, se describen en el documento de Solicitud de Patente Internacional WO 90/07861.

Se ha publicado una variedad de revisiones que tratan sobre anticuerpos con injertos de CDRs, que incluyen a Vaughan y otros (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

El TNFα es una citocina proinflamatoria que se libera e interacciona con células del sistema inmunitario. Así, el TNFα es liberado por macrófagos que se han activado con lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gran negativas. Como tal, el TNFα parece ser un mediador endógeno de gran importancia, implicado en el desarrollo y la patogénesis del choque endotóxico asociado con septicemia bacteriana. El TNFα también se ha observado que tiene una expresión incrementada en una variedad de enfermedades humanas, que incluyen enfermedades crónicas, tales como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y esclerosis múltiple. Ratones transgénicos para TNFα humano producen niveles elevados de TNFα de forma constitutiva y desarrollan una poliartritis destructiva espontánea que se asemeja a la artritis reumatoide (Kaffer y otros, EMBO J., 10, 4025-4031,1991). Por lo tanto, se hace referencia al TNFα como una citocina proinflamatoria.

Los anticuerpos monoclonales contra TNFα se han descrito en la técnica anterior. Meager y otros, (Hybridoma, 6,305-311, 1987) describen anticuerpos monoclonales de múrido contra TNFα recombinante. Fendly y otros, (Hybridoma, 6, 359-370,1987) describen el uso de anticuerpos monoclonales de múrido contra TNFα recombinante, para definir epítopos neutralizantes sobre TNF. Shimamoto y otros, (Immunology Letters, 17, 311-318, 1988) describen el uso de anticuerpos monoclonales de múrido contra TNF7 y su uso en la prevención del choque endotóxico en ratones. Además, en el documento de Solicitud de Patente Internacional WO 92/11383, se describen anticuerpos recombinantes, que incluyen anticuerpos injertados con CDR, específicos para TNFα. Rankin y otros, (British J. Rheumatology, 34, 334-342,1995) describen el uso de tales anticuerpos injertados con CDR, en el tratamiento de la artritis reumatoide. El documento US-A-5 919 452 describe anticuerpos quiméricos anti-TNF y su uso para tratar patologías asociadas con la presencia de 5 TNF.

Los anticuerpos para TNFα se han propuesto para la profilaxis y el tratamiento del choque endotóxico (Beutler y otros, Science, 234, 470-474,1985). Bodmer y otros, (Critical Care Medicine, 21, págs. 441-446, 1993) y Wherry y otros, (Critical Care Medicine, 21, págs. 436-440, 1993) describen el potencial terapéutico de anticuerpos anti-TNFα en el tratamiento del choque séptico. El uso de anticuerpos anti-TNFα en el tratamiento del choque séptico, también está descrito por Kirschenbaum y otros, (Critical Care Medicine, 26, 1625-1626, 1998). La artritis inducida con colágeno se puede tratar con eficacia usando un anticuerpo monoclonal anti-TNFα (Williams y otros (PNAS-USA, 89, 9784-9788, 1992)).

Niveles incrementados de TNFα se han encontrado en el líquido sinovial y en la sangre periférica de pacientes que sufren artritis reumatoide. Cuando se administran agentes que bloquean TNFα a pacientes que padecen artritis reumatoide, se reduce la inflamación, mejoran los síntomas y se retarda la lesión de las articulaciones (McKown y otros (Artritis Rheum., 42,1204-1208, 1999).

El uso de anticuerpos anti-TNFα en el tratamiento de la artritis reumatoide y de la enfermedad de Crohn, se describe en Feldman y otros, (Transplantation Proceedings, 30, 4126-4127, 1998), Adorini y otros, (Trends in Immunology Today, 18, 209-211, 1997) y en Feldman y otros, (Advances in Immunology, 64, 283-350, 1997). Los anticuerpos para TNFα utilizados en tales tratamientos son generalmente anticuerpos quiméricos, tales como los descritos en el documento US-A5919452.

Dos productos que bloquean el TNFα están autorizados actualmente para el tratamiento de la artritis reumatoide. El primero, llamado etanercept, está comercializado por Immunex Corporation como Enbrel®. Es una proteína de fusión recombinante que comprende dos dominios del receptor soluble p75 de TNF, ligados a la porción Fc de una inmunoglobulina humana. El segundo,... [Seguir leyendo]

1. Un método de análisis para la caracterización y la cuantificación de isómeros de disulfuro de fragmentos de anticuerpo que comprenden las etapas de: (a) pretratar el fragmento de anticuerpo con un disolvente orgánico, (b) digerir el fragmento de anticuerpo pretratado con una proteasa en presencia de un disolvente orgánico y (c) analizar los fragmentos de la digestión con proteasa.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho disolvente orgánico es acetonitrilo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha concentración de acetonitrilo en la etapa de pretratamiento (a) está entre aproximadamente 40% y 80%.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha concentración de acetonitrilo en la etapa de pretratamiento (a) es de aproximadamente 67%.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde dicha concentración de acetonitrilo en la etapa de digestión con proteasa (b) está entre aproximadamente 20% y 50%.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha concentración de acetonitrilo en la etapa de digestión con proteasa (b) es de aproximadamente 20%.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha proteasa es Lys-C o tripsina.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichos fragmentos de la digestión con proteasa se analizan empleando HPLC de fase inversa.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho fragmento de anticuerpo se selecciona entre el grupo consistente en: un fragmento Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 o Fv; un monómero

o un dímero de cadena ligera o de cadena pesada; y un anticuerpo de cadena sencilla.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un Fab.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho Fab es CDP870.

12. Un método de análisis para la caracterización y la cuantificación de productos de la degradación de fragmentos de anticuerpo y de impurezas de fragmentos de anticuerpo en proteínas recombinantes seleccionadas entre el grupo consistente en oxidaciones de metionilo, truncamientos, desamidación de asparaginas, incorporaciones indebidas, extensiones u otras degradaciones comunes de las proteínas o impurezas proteicas que comprenden las etapas de:

(a) pretratar la proteína con un disolvente orgánico, (b) digerir la proteína pretratada con una proteasa en presencia del disolvente orgánico y (c) analizar los fragmentos de la digestión con proteasa.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicha concentración de acetonitrilo en la etapa de pretratamiento (a) es de aproximadamente 50%.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha concentración de acetonitrilo en la etapa de digestión con proteasa (b) es de aproximadamente 20%.