Un procedimiento para diseñar un anticuerpo que comprende: identificar una posición tolerante a una variación en un anticuerpo parental:

i) comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo parental con las secuencias de aminoácidos de una pluralidad de anticuerpos relacionados, en el que dichos anticuerpos relacionados se unen específicamente al mismo antígeno que dicho anticuerpo parental, y en el que dichos anticuerpos relacionados y dicho anticuerpo parental se obtienen de células de un animal no humano individual inmunizado con dicho antígeno; e ii) identificando una posición tolerante a una variación como una posición en la que la identidad del aminoácido varía entre los anticuerpos individuales; en el que dicho procedimiento comprende además sustituir el aminoácido presente en dicha posición tolerante a una variación para producir un anticuerpo que se une a dicho antígeno con una afinidad de al menos el 10% de la afinidad de unión del anticuerpo parental, y que tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente a la de dichos anticuerpos relacionados monoclonales

Campo de la invención

El campo de la presente invención es anticuerpos, particularmente procedimientos para la ingeniería, por ejemplo, humanizando, anticuerpos monoclonales.

Antecedentes de la invención

Debido a su capacidad para elegir como diana prácticamente cualquier molécula con especificidad infinita, los anticuerpos monoclonales tienen el potencial de convertirse en uno de los principales agentes terapéuticos del futuro. Sin embargo, aunque este potencial fuera reconocido hace varios años, los primeros intentos por satisfacer el potencial fueron decepcionantes debido a que los anticuerpos monoclonales usados en terapia provocan una fuerte respuesta inmunitaria en pacientes (Schroff, 1985 Cancer. Res. 45:879-85, Shawler. J Immunol 1985 135:1530-5), incluso a bajas dosis (Dillman, Cancer Biother. 1994 9:17-28). Los científicos predicen que los anticuerpos humanos no producirían tales respuestas inmunitarias adversas. Sin embargo, no existen procedimientos adecuados para producir anticuerpos monoclonales humanos. Tecnologías alternativas para preparar anticuerpos humanos usando, por ejemplo, expresión en fago y animales transgénicos se han desarrollado más recientemente, pero no se usan ampliamente para fines terapéuticos.

La inmunogenicidad de anticuerpos depende de muchos factores que incluyen el procedimiento de administración, el número de inyecciones, la dosificación, la naturaleza de la conjugación, el fragmento específico utilizado, el estado de agregación y la naturaleza del antígeno (por ejemplo, Kuus-Reichel, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1994 1:365-72). Muchos o la mayoría de los factores pueden manipularse con el fin de disminuir una respuesta inmunitaria. Sin embargo, si la secuencia de anticuerpos original es reconocida como “peligrosa” o “extraña”, las oportunidades son que tarde o temprano una respuesta inmunitaria fuerte evitará el uso de ese anticuerpo en terapia.

Con el fin de reducir estas respuestas se han hecho esfuerzos por sustituir en la medida de lo posible la secuencia no humana de un anticuerpo por secuencias humanas usando tecnología de ADN recombinante. Para este fin se han empleado anticuerpos quiméricos que contienen dominios constantes de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de anticuerpos humanos que se unen a dominios variables de las cadenas ligeras y las cadenas pesadas de anticuerpos de ratón. Los anticuerpos quiméricos todavía contienen un gran número de secuencias de aminoácidos no humanas en las regiones variables y, como tales, puede organizarse una respuesta inmunitaria significativa contra tales anticuerpos. El injerto de CDR es otra técnica de humanización en la que las porciones de unión a antígeno o “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR) de anticuerpos monoclonales se injertan por tecnologías de ADN recombinante en las secuencias de ADN que codifican la región estructural (es decir, las tecnologías de ADN recombinante en las secuencias de ADN que codifican la región estructural (es decir, la región no CDR) de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos. Un problema técnico de los anticuerpos injertados en CDR es que normalmente muestran una considerable afinidad disminuida. Para restaurar el aumento de la afinidad de anticuerpos injertados en CDR, ciertos residuos de la región estructural clave original (por ejemplo, residuos que se cree que participan en la determinación de la conformación de las CDR) se reintroducen en el anticuerpo injertado en CDR. Usando un enfoque de humanización diferente, Roguska ideó una estrategia de “reestructuración” para anticuerpos de ratón en la que solo se sustituyen los residuos expuestos que son diferentes a los residuos expuestos de un anticuerpo humano. El documento US2004/0086979 describe una estrategia de reestructuración para anticuerpos de conejo.

Sin embargo, aunque los anticuerpos humanizados por los procedimientos anteriores pueden mostrar inmunogenicidad reducida en pacientes humanos (Moreland, Artritis Rheum 1993 36:307-18), muchos anticuerpos humanizados todavía son altamente inmunogénicos a una gran proporción de pacientes. Se cree que esto es debido a que las propias CDR son inmunogénicas (Ritter, Cancer Res 2001 61:6851-9; Welt, Clin Cancer Res 2003 9:133846).

Todos los procedimientos descritos anteriormente requieren que las regiones CDR del anticuerpo no humano sigan sin cambiar durante el procedimiento de humanización con el fin de mantener la especificidad y la afinidad de los anticuerpos. Sin embargo, como las regiones CDR no humanas son por sí mismas inmunogénicas en seres humanos, los procedimientos para humanizar las regiones CDR de un anticuerpo no humano sin reducir significativamente la actividad de unión del anticuerpo son altamente deseables. La identificación de procedimientos adecuados para humanizar las regiones CDR de un anticuerpo no humano ha sido una tarea desalentadora, si no imposible, para la comunidad médica y de investigación.

Por consiguiente, existe una necesidad continua de mejorar los procedimientos para preparar anticuerpos no humanos que sean menos inmunogénicos en seres humanos y otros huéspedes mamíferos. En particular, existe la necesidad de procedimientos de humanización que reduzca la inmunogenicidad de regiones CDR de un anticuerpo no humano en seres humanos. La presente invención cumple estas y otras necesidades.

Bibliografía

Referencias de interés incluyen: patentes de EE.UU. 6.331.415 B1, 5.225.539, 6.342.587, 4.816.567, 5.639.641, 6.180.370, 5.693.762, 4.816.397, 5.693.761, 5.530.101, 5.585.089, 6.329.551 y las publicaciones Morea y col., Methods 20: 267-279 (2000), Ann. Allergy Asthma Immunol. 81:105-119 (1998), Rader y col., J. Biol. Chem. 276:13668-13676 (2000), Steinberger y col., J. Bio. Chem. 275: 36073-36078 (2000), Roguska y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973 (1994), Delagrave y col., Prot. Eng. 12: 357-362 (1999), Rogusca y col., Prot. Eng. 9: 895904 (1996), Knight y Becker, Cell 60: 963-970 (1990); Becker y Knight, Cell 63:987-997 (1990) Popkov, J Mol Biol 325:325-35 (2003); Rader y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:8910-8915; Mehr y col., J Immunol. 172:4790-6 (2004) y De Pascalis y col. J Imm. 2002, 169:3076-3084.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona un procedimiento para identificar posiciones de un anticuerpo que pueden modificarse sin reducir significativamente la actividad de unión del anticuerpo. El procedimiento implica identificar una posición sustituible en un anticuerpo parental comparando su secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de varios anticuerpos relacionados, en el que dichos anticuerpos relacionados se unen específicamente al mismo antígeno que dicho anticuerpo parental, y en el que dichos anticuerpos relacionados y dicho anticuerpo parental se obtienen de células de un único animal no humano inmunizado con dicho antígeno. El aminoácido en la posición sustituible puede estar sustituido por un aminoácido diferente sin afectar significativamente la actividad del anticuerpo. Los procedimientos objeto pueden emplearse para cambiar la secuencia de aminoácidos de una CDR sin reducir significativamente la afinidad del anticuerpo del anticuerpo, en procedimientos de humanización, o en otros procedimientos de manipulación por ingeniería de anticuerpos. La invención se usa en una variedad de aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación.

Estas y otras ventajas y características de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de los detalles de la invención como se describe más completamente a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un diagrama de flujo que ilustra una realización de la invención.

La Fig. 2 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos que ilustra un procedimiento a modo de ejemplo por el que pueden identificarse posiciones sustituibles dentro de una región CDR. De arriba a abajo, las secuencias de aminoácidos mostradas en la Fig. 2 son SEQ ID NOS: 1-11.

La Fig. 3 es dos paneles que muestran un alineamiento de secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo que ilustra un aspecto de un procedimiento a modo de ejemplo por el que las regiones CDR de un anticuerpo pueden humanizarse. De arriba a abajo, las secuencias de aminoácidos mostradas en la Fig. 3 son SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 15.

La Fig. 4 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para diseñar un anticuerpo que comprende:

identificar una posición tolerante a una variación en un anticuerpo parental: i) comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo parental con las secuencias de aminoácidos de una pluralidad de anticuerpos relacionados, en el que dichos anticuerpos relacionados se unen específicamente al mismo antígeno que dicho anticuerpo parental, y en el que dichos anticuerpos relacionados y dicho anticuerpo parental se obtienen de células de un animal no humano individual inmunizado con dicho antígeno; e ii) identificando una posición tolerante a una variación como una posición en la que la identidad del aminoácido varía entre los anticuerpos individuales; en el que dicho procedimiento comprende además sustituir el aminoácido presente en dicha posición tolerante a una variación para producir un anticuerpo que se une a dicho antígeno con una afinidad de al menos el 10% de la afinidad de unión del anticuerpo parental, y que tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente a la de dichos anticuerpos relacionados monoclonales.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende comparar la secuencia de aminoácidos de una CDR de dicho anticuerpo parental con las CDR de dichos anticuerpos relacionados parentales y sustituir el aminoácido en dicha CDR.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende comparar la secuencia de aminoácidos de una región estructural de dicho anticuerpo parental con la misma región estructural de dichos anticuerpos relacionados parentales y sustituir el aminoácido en dicha región estructural.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho animal individual es un conejo, ratón o pollo individual.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el aminoácido de dicha posición tolerante a una variación está sustituido por un aminoácido presente en una posición correspondiente en uno de dichos anticuerpos relacionados.

6. El procedimiento de cualquier de las reivindicaciones 1-4, en el que el aminoácido en la posición tolerante a una variación está sustituido por un aminoácido presente en una posición correspondiente en un anticuerpo humano similar.

7. Un procedimiento de humanizar un anticuerpo monoclonal que comprende:

identificar una posición tolerante a una variación de un anticuerpo monoclonal: i) comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal con las secuencias de aminoácidos de una pluralidad de anticuerpos relacionados monoclonales, en el que dichos anticuerpos relacionados se unen específicamente al mismo antígeno que dicho anticuerpo parental, y en el que dichos anticuerpos relacionados y dicho anticuerpo parental se obtienen de células de un animal no humano individual inmunizado con dicho antígeno; e ii) identificando una posición tolerante a una variación como una posición en la que la identidad del aminoácido varía entre los anticuerpos individuales; en el que el procedimiento comprende además sustituir un aminoácido en dicha posición tolerante a una variación por un aminoácido diferente presente en una posición correspondiente de un anticuerpo humano similar para producir un anticuerpo humanizado que se une a dicho antígeno con una afinidad de al menos el 10% de la afinidad de unión del anticuerpo parental.

8. Un procedimiento de cribado de un anticuerpo monoclonal que tiene actividad mejorada que comprende:

identificar una posición tolerante a una variación de un anticuerpo monoclonal i) comparando su secuencia de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos de una pluralidad de anticuerpos relacionados monoclonales, en el que dichos anticuerpos relacionados se unen específicamente al mismo antígeno que dicho anticuerpo parental, y en el que dichos anticuerpos relacionados y dicho anticuerpo parental se obtienen de células de un animal no humano individual inmunizado con dicho antígeno; ii) identificando una posición tolerante a una variación como una posición en la que la identidad del

aminoácido varía entre los anticuerpos individuales; en el que el procedimiento comprende además sustituir un aminoácido en dicha posición tolerante a una variación con un aminoácido diferente para producir un anticuerpo de prueba; y

5 cribar dicho anticuerpo de prueba para actividad mejorada.

9. Un procedimiento de preparación de una secuencia consenso para anticuerpos que se unen a un antígeno particular que comprende: comparar las secuencias de aminoácidos de una pluralidad de anticuerpos relacionados monoclonales en el

10 que a) dichos anticuerpos relacionados se unen específicamente al mismo antígeno que dicho anticuerpo parental; y b) dichos anticuerpos relacionados y dicho anticuerpo parental se obtienen de células de un animal no humano individual inmunizado con dicho antígeno;

15 para identificar una secuencia consenso de aminoácidos para anticuerpos que se unen a dicho antígeno.