Células hospedadoras E. coli con proteínas periplásmicas de fijación al fosfato phos/psts modificadas y método de preparación de fab recombinantes.

Una célula hospedadora E. coli que expresa un anticuerpo recombinante caracterizada por que la célula hospedadora E.

coli ha sido modificada genéticamente para cambiar el punto isoeléctrico de la proteína PstS de fijación de fosfato de E. coli y en donde el punto isoeléctrico se ha alterado mediante:

la adición de una etiqueta de poliácido aspártico al terminal C de la proteína de fijación al fosfato y/o

el cambio de uno o más restos de aminoácido situados en la superficie de la proteína PstS de fijación de fosfato de E. coli por:

(a) sustitución de uno o más restos de lisina y/o arginina por ácido aspártico o ácido glutámico o

(a) sustitución de uno o más restos de ácido aspártico y/o ácido glutámico por lisina o arginina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2003/004474.

Solicitante: UCB PHARMA, S.A..

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: ALLÉE DE LA RECHERCHE 60 1070 BRUSSELS BELGICA.

Inventor/es: CHAPMAN, ANDREW PAUL, HUMPHREYS, DAVID, PAUL, ROBINSON,MARTYN KIM, SPITALI,MARIANGELA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/245 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Escherichia (G).
  • C12N1/20 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/31 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Genes que codifican proteínas microbianas, p. ej. enterotoxinas.

PDF original: ES-2541358_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Células hospedadoras E. coli con proteínas periplásmicas de fijación al fosfato phos/psts modificadas y método de preparación de fab recombinantes La presente invención se refiere a células hospedadoras E. coli para su utilización en la expresión de proteínas 5 recombinantes y más específicamente proporciona células hospedadoras E. coli mejores para la preparación de anticuerpos recombinantes.

La purificación a gran escala, económica de proteínas recombinantes es cada vez más un problema importante para la industria biotecnológica. Generalmente, las proteínas recombinantes se preparan utilizando estirpes celulares ya sea de mamífero o bacterianas transgénicas para producir la proteína de interés por inserción de un plásmido 10 recombinante que contiene el gen para esta proteína. Las proteínas se segregan ya sea directamente desde la célula en el medio de cultivo circundante o se producen intracelularmente. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un proceso de purificación implica lisis o alteración de la célula, que puede hacerse por varios métodos, como por ejemplo cizallamiento mecánico, choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicha alteración libera los contenidos de la célula en el homogeneizado, y además produce fragmentos subcelulares que se eliminan 15 generalmente por centrifugación diferencial o por filtración. El mismo problema surge, aunque a una escala más pequeña, con las proteínas directamente segregadas debido a la muerte natural de las células y a la liberación de proteínas intracelulares de las células hospedadoras en el transcurso de la ruta de producción de proteínas. Las proteínas recombinantes producidas de esta manera necesitaban ser purificadas lejos de las proteínas contaminantes de las células hospedadoras, ya que pueden ser tóxicas o inmunógenas. La alta pureza es esencial

para las proteínas recombinantes requeridas para uso terapéutico, tales como los anticuerpos.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos hasta hace poco se solían preparar en células de mamífero, pero se han utilizado también sistemas de producción alternativos tales como E. coli, levaduras Pichia y vegetales. Estas alternativas de preparación han sido guiadas por el producto del anticuerpo específico y el equilibrio entre escala, coste, velocidad, capital de riesgo y seguridad biológica (Humphreys y Glover, 2001, Current Opinion in Drug

Discover y and Development, 4, 172-185) . Además de los costes más obvios de la planta de fermentación, hora operador, ingredientes medios y tiempo requerido por el proceso/depreciación del capital, existen costes significativos relacionados con el 'tratamiento aguas abajo' es decir almacenamiento del producto en bruto, manipulación y purificación.

La purificación de anticuerpos a gran escala se basa principalmente en la precipitación fraccionada, el intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño y de interacción hidrófoba porque estos métodos son rentables y físicamente robustos. Si la purificación no puede conseguirse empleando estos métodos entonces será necesario considerable desarrollo para ampliar métodos analíticos más costosos tal como la cromatografía por afinidad. Este problema es probable que surja cuando las proteínas contaminantes del hospedador tengan propiedades físicas similares a las del anticuerpo recombinante, tal como pl, tamaño o hidrofobicidad. La eliminación de estos contaminantes puede requerir etapas de purificación de especialista que son muy indeseables cuando se realizan a gran escala. Por consiguiente hay necesidad de mejorar y simplificar los procesos de purificación a gran escala para anticuerpos preparados de manera recombinante cuando las proteínas contaminantes del hospedador son un problema específico.

O'Brien et al. Protein Expression and Purification 24, 43-50 (2002) describe la expresión bacteriana y la purificación 40 de fragmentos Fab bovinos recombinantes.

El documento WO 98/18946 describe un procedimiento para la producción bacteriana de polipéptidos.

La patente EP 0 737 747 se refiere a la expresión citoplasmática en E. coli de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y fusiones de los mismos.

La presente invención resuelve el problema descrito anteriormente al proporcionar células hospedadoras E. coli 45 mejoradas para la preparación de anticuerpos recombinantes caracterizadas por que dichas células han sido genéticamente modificadas con objeto de cambiar al menos una propiedad física de una proteína PstS de E. coli que en el tipo natural se purifica junto con dicho anticuerpo recombinante. Más específicamente, la presente invención proporciona células hospedadoras E. coli que expresan un anticuerpo recombinante caracterizado por que la célula hospedadora E. coli se ha genéticamente con objeto de cambiar el punto isoeléctrico de la proteína PstS de 50 fijación al fosfato de E. coli y en donde el punto isoeléctrico ha sido alterado por:

la adición de una etiqueta de poliácido aspártico al terminal C de la proteína de fijación al fosfato y/o el cambio de uno o más restos de aminoácido situados en la superficie de la proteína PstS de fijación al fosfato de E. coli por:

(a) substituyendo uno o más restos de lisina y/o arginina por ácido aspártico o ácido glutámico o 55 (b) substituyendo uno o más restos de ácido aspártico y/o ácido glutámico por lisina o arginina.

Así pues, los inventores han podido demostrar que el procedimiento de purificación para anticuerpos producidos en E. coli puede mejorarse alterando las propiedades físicas de las proteínas seleccionadas de E. coli de modo que ya no se purifican con el anticuerpo recombinante. Como resultado de utilizar las células hospedadoras E. coli de la presente invención es posible mejorar el procedimiento de purificación para anticuerpos producidos utilizando dichas 5 células, por ejemplo el procedimiento puede ser más rápido y/o más económico que para los producidos en E. coli natural. Por consiguiente, las mejoras en la purificación de un anticuerpo en la presente invención puede considerarse que son cualquier alteración ventajosa para un procedimiento de purificación proveniente de las modificaciones en las propiedades físicas de las proteínas del hospedador E. coli. Puede incluir mejoras pero no se limitan a mejoras en la velocidad de purificación, reducción en costes de purificación o aumento en la calidad de los anticuerpos producidos. En una realización de la presente invención el procedimiento de purificación para un anticuerpo recombinante mejora por eliminación de una etapa de purificación dando como resultado ahorros tanto de coste como de tiempo. Preferiblemente la etapa que se elimina es una etapa de cromatografía por afinidad, una etapa de intercambio iónico, una etapa de exclusión por tamaño o una etapa de interacción hidrófoba. En una realización preferida la etapa que se elimina durante la purificación de un fragmento Fab' de anticuerpo es una etapa de interacción hidrófoba y la proteína de E. coli que se altera es la proteína de fijación al fosfato (PhoS/PstS) . Preferiblemente la eliminación de dicha etapa conduce a ahorros de costes de aproximadamente 15% en comparación con el procedimiento de purificación original en base Fab' molar.

En otra realización de la presente invención, el procedimiento de purificación para anticuerpos recombinantes producidos en las células hospedadoras de la presente invención mejora al reducir la cantidad de matriz de la columna requerida, reduciendo por consiguiente los costes de material y la duración de los procesos. Preferiblemente esto se consigue reduciendo el número de proteínas contaminantes del hospedador que normalmente se purifican con el anticuerpo recombinante y reducen la capacidad de la columna para unirse al anticuerpo. En una realización preferida la capacidad de la columna que se aumenta es una columna de intercambio catiónico y las proteínas del hospedador E. coli que se alteran para evitar la fijación a esta columna son la proteína de fijación de dipéptido (DppA) , la proteína de fijación de maltosa (MBP) y la Tiorredoxina.

Por lo tanto según la presente invención se proporcionan células hospedadoras de E. coli mejoradas para la preparación de anticuerpos recombinantes. Las células hospedadoras de E. coli de la presente invención pueden ser organismos naturales u organismos mutados capaces de producir anticuerpos recombinantes. Preferiblemente, sin embargo, el organismo hospedador es un organismo o la descendencia de un organismo que se ha transformado utilizando técnicas de ADN recombinante con una secuencia heteróloga de ADN que codifica la producción de un anticuerpo recombinante. Las... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula hospedadora E. coli que expresa un anticuerpo recombinante caracterizada por que la célula hospedadora E. coli ha sido modificada genéticamente para cambiar el punto isoeléctrico de la proteína PstS de fijación de fosfato de E. coli y en donde el punto isoeléctrico se ha alterado mediante:

la adición de una etiqueta de poliácido aspártico al terminal C de la proteína de fijación al fosfato y/o el cambio de uno o más restos de aminoácido situados en la superficie de la proteína PstS de fijación de fosfato de E. coli por:

(a) sustitución de uno o más restos de lisina y/o arginina por ácido aspártico o ácido glutámico o

(a) sustitución de uno o más restos de ácido aspártico y/o ácido glutámico por lisina o arginina.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, donde el punto isoeléctrico de la proteína PstS de fijación de fosfato se ha reducido al sustituir una o más lisinas en los restos 110, 265, 266 o 318 por glutamina o ácido aspártico.

3. La célula hospedadora de la reivindicación 1, donde el punto isoeléctrico de la proteína PstS de fijación de fosfato se ha reducido mediante la adición de una etiqueta de poliácido aspártico al terminal C.

4. La célula hospedadora de la reivindicación 1, donde el punto isoeléctrico de la proteína PstS de fijación de fosfato

se ha reducido mediante la sustitución de las lisinas en los residuos 265 o 266 con glutamina y mediante la adición de una etiqueta de poli-ácido aspártico al terminal C.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 1, donde el punto isoeléctrico de la proteína PstS de fijación de fosfato se ha reducido mediante la sustitución de las lisinas en los residuos 110, 265 o 266 por glutamina y mediante la adición de una etiqueta de poli-ácido aspártico al terminal C.

6. La célula hospedadora de las reivindicaciones 1-5, donde el anticuerpo recombinante es un fragmento Fab o Fab'.

7. Un método de preparación de un anticuerpo recombinante que comprende la fermentación de una célula hospedadora según las reivindicaciones 5 o 6.


 

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