Moléculas de anticuerpo que tienen especificidad por la IL-6 humana.

Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad por la IL-6 humana,

que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia gH13 dada en la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende la secuencia gL10 dada en la SEQ ID NO: 13.

Moléculas de anticuerpo que tienen especificidad por la IL-6 humana La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpo que tienen especificidad por determinantes antigénicos de la IL-6. La presente invención se refiere también a los usos terapéuticos de las moléculas de anticuerpo y a métodos para producir las moléculas de anticuerpo.

La IL-6 es una citoquina multifuncional pleiotrópica producida por una variedad de tipos de células. Originalmente se identificó como un factor de diferenciación de linfocitos B (BSF-2) que inducía la mutación final de linfocitos B en células que producían anticuerpos (Hirano et al., 1986 Nature 324, 73-76) . Se ha mostrado que la IL-6 tiene una función central en la regulación inmunitaria, inflamación, hematopoyesis y oncogénesis. Dentro del sistema inmunitario, la IL-6 induce la producción de anticuerpos de linfocitos B aumentando la cantidad de inmunoglobulina policlonal. También induce la expresión del receptor de interleuquina-2 (IL-2) en linfocitos T (Nomo et al., 1987, Immunol. letters, 15, 3, 249-253) y promueve la producción de IL-2 en linfocitos T activados induciendo así tanto el crecimiento como la diferenciación de linfocitos T citotóxicos (Okada et al., 1988 J. Immunol., 141, 5, 1543-1549) . También se sabe que la IL-6 determina la diferenciación de monocitos en macrófagos (Chomarat P et al., 2000 Nature Immunol., 6, 510-514) .

La función de la IL-6 no está restringida a la respuesta inmunitaria ya que actúa en la hematopoyesis, trombopoyesis, formación de osteoclastos, producción de respuesta hepática en fase aguda que da como resultado el aumento de la proteína C reactiva (CRP) y proteína amiloide sérica (SAA) . Se sabe que es un factor de crecimiento para queratinocitos epidérmicos, células mesangiales renales, mieloma y células plasmacitoides (Grossman et al., 1989 Prot. Natl. Acad. Sci., 86, (16) 6367-6371; Horii et al., 1989, J. Immunol., 143, 12, 3949-3955; Kawano et al., 1988, Nature 332, 6159, 83-85) . La IL-6 es producida por una amplia variedad de tipos de células incluyendo monocitos/macrófagos, fibroblastos, queratinocitos epidérmicos, células endoteliales vasculares, células mensagiales renales, células gliales, condrocitos, linfocitos T y B y algunas células tumorales (Akira et al., 1990, FASEB J., 4, 11, 2860-2867) . Excepto por las células tumorales que producen de forma constitutiva IL-6, las células normales no expresan IL-6 salvo que se estimulen de forma adecuada.

La IL-6 es una glicoproteína, una molécula de 184 aminoácidos con un peso molecular de 21 a 28 kD dependiendo de las modificaciones postraduccionales. Las variantes de corte y empalme alternativas se encuentran en algunos tipos de células (Kishimoto et al., 1995, Blood, 86, 4, 1243-1254) . El complejo del receptor de IL-6 (IL-6R) está compuesto de dos proteínas de membrana de diferente funcionalidad, una cadena de unión específica a IL-6 de 80 kD (gp80) y una cadena de transducción de señal de 130 kD (gp130) . Aunque la IL-6 no puede unirse directamente a gp130, se puede unir al IL-6R para generar un complejo ternario de alta afinidad de IL-6/IL-6R/gp130. El IL-6R se une a la IL-6 con baja afinidad, sin embargo el IL-6R no tiene un dominio de transducción de señal intracelular, por consiguiente, está unión sola no conduce a la activación celular. De forma similar, la expresión de superficie celular del IL-6R no significa que la célula responda a la estimulación por la IL-6. La escisión proteolítica conduce a la liberación de IL-6R soluble (sIL-6R; sgp80) que se puede unir a la IL-6 en la circulación y aumentar la semivida de la IL-6. Para la activación celular, la IL-6 primero se une a la célula unida al IL-6R o sIL-6R; el complejo heterodímero IL-6/IL-6R se asocia entonces con la glicoproteína de superficie celular gp130. El heterocomplejo tripartito resultante se une a otro IL-6/IL-6R/gp130 y resulta la transducción de señales (Bravo y Heath 2000, EMBO J., 19, (11) , 23992411; Boulanger et al., 2003, Science, 300, 5628, 2101-2104) , de modo que tanto el IL-6R unido a célula como el soluble contribuyen a la activación celular. La señalización de IL-6 a través del IL-6R unido a célula se ha denominado señalización cis, mientras que la activación celular a través de IL-6R soluble se ha descrito como señalización trans . Las células que expresan gp130 pero no IL-6R pueden ser estimuladas por la IL-6 a través del sIL-6R.

Los anticuerpos murinos neutralizantes contra IL-6 humana se sabe que pueden interferir con la unión de la IL-6 humana al IL-6R (sitio 1) o a gp130 (sitios 2 y 3) (Kalai et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 690-700; Brakenhoff et al., 1990, Journal of Immunology, 145, 561-568; Wendling et al., 1993, Journal of Rheumatology, 29, 259-262) .

La patente de EE.UU. nº 5.856.135 describen anticuerpos humanos remodelados contra IL-6 humana que bloquean la unión de la IL-6 al IL-6R. Estos anticuerpos se obtuvieron de un anticuerpo monoclonal de ratón SK2 en el que se trasplantan regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable del anticuerpo de ratón SK2 a las regiones variables de un anticuerpo humano.

También son conocidos auto-anticuerpos humanos neutralizantes contra IL-6 (Hansen et al, Eur. J. Immunol., 1995, 25, 348-354) .

Se ha descrito un anticuerpo quimérico murino/humano anti-IL6 del sitio I en el documento WO2004039826 para usar en terapia.

Un anticuerpo monoclonal humanizado anti-receptor de IL-6 humana está en ensayos clínicos en fase III para el tratamiento de la artritis reumatoide (Kishimoto, 2005, Annu. Rev. Immunol. 23:1-21) . También se ha informado que el mismo anticuerpo es eficaz en el estudio en fase II de la enfermedad de Crohn. La eficacia también se ha demostrado tanto con los anticuerpos anti-IL-6 como los anti-IL-6R en la enfermedad similar a lupus en ratones

NZB/W F1 (Fink et al., 1994 J. Clin. Invest. 94, 585; Mihara et al., 1998, Clin. Exp. Immunol. 112, 397) . Un anticuerpo neutralizante contra el receptor de IL-6 murino suprimía la colitis en un modelo de transferencia adoptiva de enfermedad (Yamamoto et al., 2000 Journal of Immunology, 164, 4878; Atreya et al., 2000 Nature Med 6, 583) . El último estudio también demostraba eficacia con un anticuerpo anti-receptor en el modelo de ratón con genes de IL10 inactivados y en el modelo de TNBS de inflamación del intestino.

Los autores de la invención ahora han identificado un anticuerpo anti-IL-6 neutralizante de alta afinidad que es particularmente eficaz in vivo, por ejemplo, en el modelo in vivo descrito en la presente memoria, en particular un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad para la IL-6 humana, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia gH13 dada en la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende la secuencia gL10 dada en la SEQ ID NO: 13.

Los restos de los dominios variables de anticuerpo se numeran convencionalmente según un sistema creado por Kabat et al. Este sistema está descrito por Kabat et al., 1987, en Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (de aquí en adelante "Kabat et al. (cita anterior) ") .Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva excepto cuando se indica otra cosa.

Las designaciones de los residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que los de la numeración estricta de Kabat que corresponde a un acortamiento de un componente estructural o a una inserción en un componente estructural, ya sea región armazón o región determinante de la complementariedad (CDR) , de la estructura del dominio variable básico. La numeración correcta de Kabat de los restos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineamiento de los restos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

Las CDR del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los restos 31-35 (CDR-H1) , restos 50-65 (CDR-H2) y restos 95-102 (CDR-H3) según la numeración de Kabat. Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987) ) , el bucle equivalente a la CDR-H1 se extiende del resto 26 al resto 32. Por lo tanto, "CDR-H1", como se usa en la presente memoria, comprende los restos 26 a 35, descrito por una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición de bucle topológico de Chothia.

Las CDR del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los restos 24-34 (CDR-L1) , restos 50-56 (CDR-L2) y restos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración de... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad por la IL-6 humana, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia gH13 dada en la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera que comprende la secuencia gL10 dada en la SEQ ID NO: 13.

2. Un anticuerpo neutralizante que tiene especificidad por la IL-6 humana según la reivindicación 1, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 16 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 18.

3. Una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2.

4. Una secuencia de ADN aislada según la reivindicación 3, en la que la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15 o los nucleótido.

5. 2008 de la SEQ ID NO: 15.

5. Una secuencia de ADN aislada según la reivindicación 4, en la que la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 17 o los nucleótido.

6. 705 de la SEQ ID NO: 17.

6. Un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5.

7. Un vector según la reivindicación 6, en donde el vector comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 15 y la secuencia dada en la SEQ ID NO: 17.

8. Una célula hospedante para la expresión de un anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende:

i) una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo, y

ii) una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en donde las secuencias de ADN se proporcionan en uno o más vectores de clonación o expresión.

9. Una célula hospedante según la reivindicación 8, que comprende uno o más vectores de clonación o expresión según la reivindicación 6 o reivindicación 7.

10. Una célula hospedante según la reivindicación 8, en donde la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 15 o los nucleótido.

5. 2008 de la SEQ ID NO:

15.

11. Una célula hospedante según la reivindicación 10, en donde la secuencia de ADN que codifica la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 17 o los nucleótido.

6. 705 de la SEQ ID NO: 17.

12. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo que tiene especificidad de unión por la IL-6 humana, que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 8 a 11 y aislar el anticuerpo.

13. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13, que además comprende otros principios activos.

15. El anticuerpo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13 o reivindicación 14, para usar en terapia.

16. Un anticuerpo según la reivindicación 1 o reivindicación 2, o una composición farmacéutica según la reivindicación 13 o reivindicación 14, para usar en el tratamiento o profilaxis de un trastorno patológico seleccionado del grupo que consiste en infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias) , choque endotóxico asociado con infección, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil (AIJ) de inicio sistémico, lupus eritematoso sistémico (SLE) , asma, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome del intestino irritable, enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante, dermatomiositis, uveítis, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes de tipo I, artritis de Lyme, meningoencefalitis, trastornos inflamatorios inmunomediados del sistema nervioso central y periférico, tales como la esclerosis múltiple y síndrome de Guillain-Barr, otros trastornos autoinmunitarios, pancreatitis, traumatismo (cirugía) , enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplantes, cáncer (tanto tumores sólidos tales como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de células escamosas, cánceres

de células transicionales, cánceres de ovario, como tumores malignos hematológicos y, en particular, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, cáncer gástrico y cáncer de colon) , enfermedades del corazón, incluyendo enfermedades isquémicas tales como el infarto de miocardio, así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, pacientes con quemaduras, osteoporosis, periodontitis e hipoclorhidria.

17. El anticuerpo o composición farmacéutica según la reivindicación 16 para dicho uso, en donde el trastorno patológico se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil (AIJ) de inicio sistémico, lupus eritematoso sistémico (SLE) , asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante y cáncer.

18. El anticuerpo o composición farmacéutica según la reivindicación 16 para dicho uso, en donde el trastorno 10 patológico es la artritis reumatoide.