PROTEÍNAS DE UNIÓN TRIMÉRICAS PARA CITOCINAS TRIMÉRICAS.

La presente invención se refiere a la disposición de proteínas de unión triméricas que se unen a citocinas triméricas. En particular se proporciona agentes de unión triméricos que se unen de tal manera que tras la unión, todos los sitios de unión a receptor de la citocina trimérica se bloquean sustancialmente, y por tanto la actividad biológica potencial de la citocina trimérica se suprime. En un aspecto, la invención se refiere a agentes de unión triméricos que pueden unirse a citocinas de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral, que incluye factor de necrosis tumoral (TNF). Antecedentes de la invención y técnica anterior ES 2 367 749 T3 Las citocinas son pequeños polipéptidos segregados de eucariotas superiores que son responsables de la transducción de señales intercelulares y que afectan al crecimiento, división y funciones de otras células. Son polipéptidos potentes, pleiotrópicos que, por ejemplo por medio de receptores correspondientes, actúan como factores reguladores intercelulares locales o sistémicos, y por tanto desempeñan papeles cruciales en muchos procesos biológicos, tales como inmunidad, inflamación y hematopoyesis (formación y desarrollo de células sanguíneas en la médula ósea). Las citocinas se producen mediante diversos tipos celulares que incluyen fibroblastos, células endoteliales, macrófagos/monocitos y linfocitos. Hasta el momento se han identificado un gran número de citocinas, incluyendo interferones, factores de necrosis tumoral, interleucinas y linfocinas. Se diferencian de las hormonas clásicas porque se producen por varios tejidos o tipos de células distintas de las glándulas especializadas. La modulación de las interacciones citocina-receptor puede ser un mecanismo útil para la intervención terapéutica en diversas enfermedades y patologías. Las proteínas de unión solubles, que pueden interaccionar con citocinas, pueden secuestrar potencialmente la citocina alejándola del receptor, reduciendo o previniendo de ese modo la activación de esa ruta de receptor particular. Ciertas citocinas se producen como complejos de múltiples subunidades que contienen múltiples copias de la misma subunidad. El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y proteínas dentro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNFLSF), tal como el factor de necrosis tumoral (TNF; miembro 2 de TNFLSF) y linfotoxina alfa (LT-alfa; miembro 1 de TNFLSF), se producen como homotrímeros formados por tres subunidades idénticas. Se sabe que muchas de estas citocinas triméricas están implicadas en la transducción de señales y actúan como factores reguladores, y que están implicadas en muchos tipos diferentes de enfermedades e indicaciones médicas. Se sabe que las citocinas triméricas de la superfamilia de ligandos del TNF controlan y organizan las respuestas inmunitarias e inflamatorias a varios niveles. Se sabe también que los miembros de la superfamilia de ligandos del TNF están asociados con varias afecciones patológicas, tales como afecciones inflamatorias agudas o crónicas. Actualmente, la superfamilia de ligandos del TNF tiene al menos 17 ligandos reconocidos, que incluyen LTA (linfotoxina alfa; miembro 1 de TNFLSF), TNF (factor de necrosis tumoral; miembro 2 de TNFLSF), LTB (linfotoxina beta; miembro 3 de TNFLSF), OX-40L (miembro 4 de TNFLS); CD40L (miembro 5 de TNFLS); FasL (miembro 6 de TNFLS); CD27L (miembro 7 de TNFLS); CD30L (miembro 8 de TNFLS); 4-1 BB-L (miembro 9 de TNFLS); TRAIL (miembro 10 de TNFLS); RANKL (miembro 11 de TNFLS); TWEAK (miembro 12 de TNFLS); APRIL (miembro 13 de TNFLS); BAFF (miembro 13B de TNFLS); LIGHT (miembro 14 de TNFLS); VEGI (miembro 15 de TNFLS); y GITRL (miembro 18 de TNFLS). Existen pruebas de que la unidad de señalización de las citocinas triméricas de la superfamilia de ligandos del TNF y sus correspondientes receptores, se encuentra en la forma de tres receptores y tres ligandos ensamblados como complejo hexamérico en el que un único trímero de citocina se une a tres moléculas de receptor (Bodmer et al. 2002, TRENDS in Biochemical Sciences 27(1), pág. 19-26). Antes de formar parte de este complejo hexamérico, los receptores existen en forma monomérica. Este mecanismo general se ilustra en la figura 1. El TNF (miembro 2 de TNFLSF) es uno de los mediadores principales de la respuesta inmunitaria e inflamatoria, y se sabe, por ejemplo, que tiene un papel importante en la patogénesis de la artritis reumatoide, que es una enfermedad inflamatoria autoinmunitaria común que afecta aproximadamente al 0,5-1% de la población humana. Adicionalmente, también se sabe que el TNF está implicado en la patogénesis de una amplia gama de estados patológicos, que incluyen choque endotóxico, malaria cerebral y reacción injerto frente a huésped. El TNF se produce por varios tipos de células, principalmente por macrófagos activados. La forma soluble de TNF está constituida por tres subunidades de proteína de 17 kD idénticas, mientras que la forma unida a membrana está constituida por tres subunidades de 26 kD idénticas. El TNF se conoce también previamente como TNF-alfa y caquectina. Wüest et al (Oncogene vol. 21, n.º 27 pág. 4257-4265) se refieren a proteínas de fusión triméricas que comprenden TNF y un dominio de trimerización. Peng et al (J.Virology vol. 73, n.º 6 pág. 5098-5109) dan a conocer las proteínas 2 de fusión TNFR-CD8. ES 2 367 749 T3 Se encontró recientemente que TWEAK (miembro 2 de TNFLSF) es un inductor directo y fuerte de la angiogénesis (formación y crecimiento de vasos sanguíneos) tal como se observó que las concentraciones picomolares de TWEAK promueven la proliferación de células endoteliales normales y que TWEAK induce angiogénesis en un modelo de córnea de rata in vivo (Lynch et al., 1999, The Journal of Biological Chemistry, 274(13) pág. 8455-8459). En particular, la angiogénesis es esencial para el crecimiento y persistencia de tumores sólidos y sus metástasis, y se sabe también que está implicada en otras afecciones patológicas tales como retinopatía diabética, psoriasis, dermatitis por contacto y restenosis. El documento US5716805 se refiere a un procedimiento para preparar proteínas oligoméricas solubles. En el documento US20020037852A1 se describió la citocina trimérica BAFF (miembro 13B de TNFLS) que se expresaba por células T y células dendríticas para el fin de la coestimulación de células B y por consiguiente puede desempeñar un papel importante en el control de la función de las células B. Se sugiere en el mismo que BAFF y su receptor pueden tener aplicaciones anticancerígenas e inmunorreguladoras así como usos para el tratamiento de trastornos inmunosupresivos tales como VIH. Drickamer, Kurt (Current Opinion in Structural Biology, vol. 9, n.º 5) da a conocer las formas triméricas de CTLD en relación con tetranectina. APRIL (miembro 13 de TNFLS) es una citocina trimérica que se une al receptor TNFRSF13B y al TNFRSF17. Se ha demostrado recientemente que la adición de APRIL recombinante a diversas células tumorales estimula su proliferación y por tanto APRIL puede estar implicada en la regulación del crecimiento de células tumorales (Hahne M., et al, 1998; J. Exp. Med. 188: 1185-1190). Se ha sugerido también que APRIL puede estar implicada en procesos inmunológicos mediados por monocitos/macrófagos. Además, se ha descrito también que las citocinas dentro de la superfamilia de TNF están implicadas en enfermedades hereditarias tales como el síndrome de hiper IgM, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario tipo I, síndrome de fiebre periódica asociada a TNF-R1, displasia ectodérmica hipohidrótica y osteólisis familiar expansiva. Se han realizado varios intentos con el fin de encontrar y desarrollar antagonistas y agentes de unión adecuados para citocinas triméricas que pueden unirse a citocinas triméricas específicas y pueden evitar por tanto que las citocinas triméricas se unan a por ejemplo receptores unidos a la membrana celular y por tanto pueden suprimir la activación de esa ruta de receptor particular. Un ejemplo es antagonistas frente a la citocina trimérica TNF (miembro 2 de TNFLSF). Actualmente, dos tipos de antagonistas de TNF están comercialmente disponibles, concretamente Infliximab (Remicade) y Eternarcept (Enbrel) que han recibido ambos la autorización de comercialización en los Estados Unidos y Europa para el tratamiento de artritis reumatoide. Los dos productos han demostrado también que son eficaces para el tratamiento de psoriasis y enfermedad de Chrohn. Infliximab es un anticuerpo quimérico con regiones variables murinas y regiones constantes de IgG1 y ? humanas, que neutraliza la actividad biológica de TNF mediante la unión a las formas solubles y transmembranas de TNF e inhibe la unión de TNF con sus receptores. La estructura de Infliximab es similar... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, comprendiendo cada uno de dichos monómeros un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina trimérica, y comprendiendo cada uno de dichos monómeros un dominio de trimerización derivado de tetranectina. 2. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el dominio de trimerización derivado de tetranectina comprende una secuencia que tiene al menos un 68% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de SEC ID N.º:81. 3. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 2, en el que la identidad de secuencia de aminoácidos es al menos un 75%, tal como al menos un 87%, incluyendo al menos un 92%. 4. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el dominio de trimerización derivado de tetranectina comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º:81. 5. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, seleccionado del grupo constituido por TN-2-B (SEC ID N.º:106), TN-2-C (SEC ID N.º:108), TN-2-D (SEC ID N.º:107) y AD1D4-GSS-I10 (SEC ID N.º:109). 6. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que la citocina trimérica es un miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral. 7. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 6, en el que el miembro de la superfamilia de ligandos del factor de necrosis tumoral se selecciona del grupo que consiste en LTA; TNF; LTB; TNFSF4; TNFSF5; TNFSF6; TNFSF7; TNFSF8; TNFSF9; TNFSF10; TNFSF11; TNFSF12; TNFSF13; TNFSF13B; TNFSF14; TNFSF15; y TNFSF18. 8. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 6, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido derivado de un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral. 9. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 6, en el que el miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral se selecciona del grupo que consiste en TNFRSF1A, TNFRSF1B, LTBR, TNFRSF4, TNFRSF5, TNFRSF6, TNFRSF6B, TNFRSF7, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12, TNFRSF12L, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF Fn14, NGFR, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF19L, TNFRSF21, TNFRSF22 y TNFRSF23. 10. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico se deriva de TNFRSF1A (receptor p55 TNF). 11. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico se deriva de TNFRSF1B (receptor p75 TNF). 12. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 11, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B 1-235 (SEC ID N.º:76), TNFRSF1B 1-185 (SEC ID N.º:77), TNFRSF1B 1-163 (SEC ID N.º:78) y TNFRSF1B 1-142 (SEC ID N.º:79). 13. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 11, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B D1D2 (SEC ID N.º:13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEC ID N.º:15), TNFRSF1B D1D2 1/4 (SEC ID N.º:17), TNFRSF1B D1D2, 1/3 (SEC ID N.º:19), TNFRSF1B D1D2, 1/2 (SEC ID N.º:21), TNFRSF1B D1D4 (SEC ID N.º:23), TNFRSF1B D2 (SEC ID N.º:25), TNFRSF1B D2, 1/6 (SEC ID N.º:26), TNFRSF1B D2, 1/4 (SEC ID N.º:27), TNFRSF1B D2, 1/3 (SEC ID N.º:28), TNFRSF1B D2, 1/2 (SEC ID N.º:29) y TNFRSF1B D2D4 (SEC ID N.º:30). 14. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. 15. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a TNF humano (SEC ID N.º:80) en al menos una región seleccionada de las regiones constituidas por residuos de aminoácidos 1-18, 1-20, 1-26, 1-30, 12-22, 22-31, 22-40, 36-45, 49-97, 49-98 , 56-79, 58-65, 69-97, 70-87, 76-90, 96-105, 105-128, 108-128, 110-127, 115-125, 117-128, 132-157, 135-155, 136-153, 138-149, 141-153 y 146-157. 16. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 15, en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se selecciona de MAb 1 (ECACC 89080301), MAb 21 (ECACC 90012432), MAb 25 (ECACC 89121401), MAb 32 (ECACC 89080302), MAb 37 (ECACC 89080303), MAb 42 (ECACC 89080304), MAb 47 (ECACC 89121402), MAb 53 (ECACC 90012433) y MAb 54 (ECACC 89083103) o un fragmento del mismo. 17. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es D2E7 o un fragmento del mismo. 18. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es CDP 870 o un fragmento del 72 mismo. ES 2 367 749 T3 19. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico es una proteína que tiene la estructura de armazón proteínico de dominios similar a lectina de tipo C (CTLD). 20. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 19, en el que el miembro de unión específico que tiene la estructura de armazón proteínico de dominios similar a lectina de tipo C se selecciona del grupo que consiste en TN3-2-B (SEC ID N.º:103), TN3-2-C (SEC ID N.º:104) y TN3-2-D (SEC ID N.º:105). 21. Un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, que comprende además un ligador entre el miembro de unión específico y el dominio de trimerización. 22. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21. 23. Un procedimiento para la preparación de un polipéptido trimérico que comprende tres monómeros, comprendiendo cada uno de dichos monómeros un miembro de unión específico que puede unirse a una citocina polipeptídica trimérica, y comprendiendo cada uno de dichos monómeros un dominio de trimerización según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de (i) cultivar un huésped transformado con un vector que codifica dicho polipéptido trimérico en condiciones tales que se expresa dicho polipéptido trimérico; y (ii) aislar dicho polipéptido trimérico. 24. Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicho miembro de unión específico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B 1-235 (SEC ID N.º:76), TNFRSF1B 1-185 (SEC ID N.º:77), TNFRSF1B 1-163 (SEC ID N.º:78) y TNFRSF1B 1-142 (SEC ID N.º:79). 25. Un procedimiento según la reivindicación 23, en el que el miembro de unión específico es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en TNFRSF1B D1D2 (SEC ID N.º:13), TNFRSF1B D1D2, 1/6 (SEC ID N.º:15), TNFRSF1B D1D2 1/4 (SEC ID N.º:17), TNFRSF1B D1D2, 1/3 (SEC ID N.º:19), TNFRSF1B D1D2, 1/2 (SEC ID N.º:21), TNFRSF1B D1D4 (SEC ID N.º:23), TNFRSF1B D2 (SEC ID N.º: 25), TNFRSF1B D2, 1/6 (SEC ID N.º:26), TNFRSF1B D2, 1/4 (SEC ID N.º:27), TNFRSF1B D2, 1/3 (SEC ID N.º: 28), TNFRSF1B D2, 1/2 (SEC ID N.º:29) y TNFRSF1B D2D4 (SEC ID N.º:30). 26. Un polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para su uso como medicamento. 27. Un polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, para el tratamiento de una enfermedad mediada por citocina trimérica. 28. Uso de un polipéptido trimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad mediada por citocina trimérica. 29. Un procedimiento de ensayo para detectar una citocina trimérica en una muestra que comprende (i) poner en contacto dicha muestra con un polipéptido trimérico según la reivindicación 1, y (ii) detectar la unión del polipéptido trimérico a la citocina trimérica. 73 ES 2 367 749 T3 74 ES 2 367 749 T3 ES 2 367 749 T3 76 ES 2 367 749 T3 77