Un polinucleótido que codifica el polipéptido expuesto en una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 3 ó 4

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al diagnóstico de la proliferación de células anormales en muestras biológicas y al cribado de fármacos que inhiben, reducen o suprimen el crecimiento celular, especialmente crecimiento celular tumorigénico, detectando una isoforma fosfovariante de un novedoso biomarcador del factor de intercambio de 5 guanina-nucleótido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los factores de intercambio de guanina-nucleótido (“GEF”) estimulan la disociación del producto fibrolítico de GTP, GDP, de pequeñas proteínas de unión a GTP para promover la unión de una nueva molécula de GTP. Como resultado, este intercambio facilitado por GEF de GDP a GTP está asociado a cambios estructurales en la proteína de unión a 10 GTP que influyen en el grado con el que la proteína de unión a GTP puede interactuar con otras moléculas. Si el GTP está unido, por ejemplo, las proteínas Ras pueden interactuar con efectores y otras moléculas para afectar la proliferación, diferenciación y apoptosis celulares.

Está empezando a entenderse la posible importancia de GEF en la localización espacial de cambios en el citoesqueleto de actina. Véase Shamah y col., Cell, 20:105(2):233-44, 2001. Desde una perspectiva evolucionista, este 15 control espacial se satisface porque el Cdc24 de S. cerevisiae relativa distante, un GEF para Cdc42, desempeña una función clave en la elección como diana de cambios citoesqueléticos para diferentes dominios espaciales de la célula en respuesta a diferentes señales, O'Shea y col., Nature Cell Biol., 2(3) :E39-41, 2000.

Ren y col. (J. Biol. Chem (1998), 273(52), 34954-34960) describen la clonación y la caracterización de GEF-H1. El documento WO 99/63073A desvela la clonación y la caracterización de PAK4. Callow, Marinella G y col. (J. Biol. Chem 20 (2001), 277(1), 550-558) sugieren que la actividad de PAK4 se requiere para el crecimiento independiente de anclaje de líneas de células cancerosas humanas.

Por tanto, las técnicas existentes y el conocimiento actual no han usado ni tratado las interacciones de GEF-H1 con otras proteínas como medio por el que pueda controlarse la proliferación celular o desarrollarse la detección y el tratamiento de células y tejidos cancerosos tumorigénicos. 25

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Por consiguiente, la presente invención prevé un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de GEF-H1b de SEC ID Nº: 2, además de un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 1. En este contexto, la invención también contempla un polipéptido de GEF-H1b aislado que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 2.

En otra realización se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el péptido de GEF-H1 de SEC ID Nº: 3. La 30 invención también prevé un péptido que consiste esencialmente en la secuencia de SEC ID Nº: 3. En un modo similar, otra realización proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el péptido de GEF-H1 de SEC ID Nº: 4. En otra realización también se proporciona un péptido que consiste esencialmente en la secuencia de SEC ID Nº: 4. En una realización preferida se proporciona un polipéptido de GEF-H1 que carece de la región de aminoácidos entre los residuos 162 y 354 de SEC ID Nº: 2. En una realización preferida, el GEF-H1 es GEF-H1b. La presente invención prevé 35 formas fosforiladas de uno cualquiera de estos péptidos, polipéptidos y proteínas de GEF-H1. Por tanto, en una realización se proporcionan péptidos que comprenden las secuencias descritas en SEC ID Nº: 2, 3 ó 4 que contienen al menos un residuo fosforilado. En una realización preferida, el residuo fosforilado es una serina. En una realización preferida, la serina es serina-67 y/o serina-810 de SEC ID Nº: 2. En otra realización, la serina-67 está presente en un péptido de menos de 30 aminoácidos que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 4. En otra realización, el péptido que 40 comprende la secuencia de SEC ID Nº: 4 tiene menos de 25 aminoácidos de longitud. Preferentemente, este péptido tiene menos de 20 aminoácidos de longitud. En una realización más preferida, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 4 tiene 18 aminoácidos de longitud.

En otra realización, la serina-810 está presente en un péptido de menos de 30 aminoácidos que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 3. En otra realización, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 3 tiene menos 45 de 25 aminoácidos de longitud. Preferentemente, este péptido tiene menos de 20 aminoácidos de longitud. En una realización más preferida, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 3 tiene 18 aminoácidos de longitud.

La presente invención también contempla anticuerpos producidos para detectar uno cualquiera de estos péptidos, polipéptidos o proteínas. Por tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo específico para GEF-H1 que se produce contra y se une a un péptido que comprende la secuencia descrita en SEC ID Nº: 3. En otra realización se 50 proporciona un anticuerpo específico para GEF-H1 que está dirigido contra y se une a un péptido que comprende la secuencia descrita en SEC ID Nº: 4. Los anticuerpos de la presente invención pueden marcarse. Preferentemente, la marca es una marca fluorescente o una marca radiactiva.

En otra realización, el anticuerpo es una parte de un kit de diagnóstico usado para realizar los procedimientos inventivos descritos en el presente documento. Por tanto, en una realización, el kit incluye un primer recipiente que contiene el anticuerpo y un segundo recipiente que tiene un conjugado de un componente de unión del anticuerpo y una marca tal como, por ejemplo, un radioisótopo. En otra realización, el kit de diagnóstico también puede incluir la notificación de un uso aprobado por la FDA e instrucciones para el mismo. 5

En otra realización más se proporciona una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que tiene afinidad de unión específica para un polipéptido de GEF-H1 o un dominio de polipéptido.

En otra realización más, un anticuerpo específico para GEF-H1 se dirige contra y se une a péptidos de GEF-H1 fosforilado. Por tanto, una realización comprende un péptido que comprende la secuencia descrita en SEC ID Nº: 3 que posee una serina fosforilada. Preferentemente, la serina fosforilada en ese péptido es serina-810 de SEC ID Nº: 2. En 10 otra realización, el anticuerpo específico para GEF-H1 se dirige contra y se une a un péptido que comprende la secuencia descrita en SEC ID Nº: 4 en el que la serina-67 está fosforilada. La numeración de estas serinas en SEC ID Nº: 3 y 4 como serina-810 y serina-67 respectivamente indica la numeración de la secuencia de proteínas de longitud completa de GEF-H1, específicamente GEF-H1S de SEC ID Nº: 2.

Otros péptidos descritos en el presente documento incluyen un péptido que comprende al menos uno de SEC ID Nº: 6 15 o SEC ID Nº: 20. En otra realización se proporciona un péptido que consiste esencialmente en al menos uno de SEC ID Nº: 6 o SEC ID Nº: 20. En otra realización más se proporciona un péptido de menos de 30 aminoácidos que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 6. En otra realización, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 6 tiene menos de 25 aminoácidos de longitud. Preferentemente, este péptido tiene menos de 20 aminoácidos de longitud. En una realización más preferida, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 6 tiene 18 aminoácidos de longitud. 20

En el presente documento también se describe un péptido de menos de 30 aminoácidos que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 20. En otra realización, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 20 tiene menos de 25 aminoácidos de longitud. Preferentemente, este péptido tiene menos de 20 aminoácidos de longitud. En una realización más preferida, el péptido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 20 tiene 18 aminoácidos de longitud.

También se contemplan ácidos nucleicos que codifican proteínas de GEF-H1 de la presente invención. Por tanto, en 25 una realización se proporciona un polinucleótido que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 1. En otra realización se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito en una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 3, 4, 6 ó 20. En otra realización más se proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene menos de 90 nucleótidos de longitud y que codifica un péptido que comprende la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica el polipéptido expuesto en una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 3 ó 4.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1.

3. Un polipéptido de GEF-H1b aislado que comprende la secuencia de SEC ID Nº: 2. 5

4. El polipéptido de la reivindicación 3, en el que el polipéptido carece de los residuos de aminoácidos entre 162 y 354 de SEC ID Nº: 2.

5. Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 ó 4.

6. El polipéptido o péptido según la reivindicación 3 ó 5, en el que el polipéptido o péptido comprende al menos un aminoácido fosforilado. 10

7. Un complejo de GEF-H1b/PAK4 aislado, en el que GEF-H1b comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 2.

8. Un procedimiento para detectar actividad de PAK4 en una muestra que comprende detectar la presencia o el nivel de GEF-H1 fosforilado, en el que la detección de GEF-H1b fosforilado indica la presencia de al menos una PAK4 activa, y en el que dicho GEF-H1b comprende la secuencia expuesta en una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 3 ó 4. 15

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha PAK4 está en una célula.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha célula es una célula tumoral.

11. Un procedimiento de identificación de una sustancia que modula la interacción entre PAK4 y el polipéptido de GEF-H1b que comprende: (a) exponer el polipéptido de GEF-H1b a una sustancia candidata para formar una mezcla y luego (b) introducir en dicha mezcla una enzima PAK4; y (c) medir la cantidad de polipéptido de GEF-H1b fosforilado antes y 20 después de exponer dicho polipéptido de GEF-H1b a dicha sustancia candidata, en el que una disminución o un aumento en la cantidad de polipéptido de GEF-H1b fosforilado después de la exposición a dicha sustancia candidata indica que dicha sustancia candidata es una sustancia que modula la interacción entre PAK4 y el polipéptido de GEF-H1b, en el que dicho polipéptido de GEF-H1b comprende la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, 3 ó 4.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que en (a) PAK4 se expone a una sustancia candidata y en (b) un 25 polipéptido de GEF-H1b se introduce en la mezcla.

13. El procedimiento de la reivindicación 11 ó 12, en el que dicho polipéptido de GEF-H1b tiene la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3 o SEC ID Nº: 4.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la etapa de determinar si GEF-H1b se fosforila en la etapa (c) se realiza usando un anticuerpo específico para GEF-H1b dirigido contra un péptido que 30 comprende al menos una de serina-810 fosforilada de SEC ID Nº: 2 o serina-67 fosforilada de SEC ID Nº: 2 para detectar GEF-H1 fosforilado.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en el que dicha sustancia candidata produce una disminución en la fosforilación total de GEF-H1b.

16. Un anticuerpo específico para GEF-H1b dirigido contra la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o 35 SEC ID Nº: 4.

17. El anticuerpo específico para GEF-H1b de la reivindicación 16, en el que dicha secuencia de aminoácidos comprende una serina fosforilada.

18. El anticuerpo específico para GEF-H1b de la reivindicación 17, en el que dicha serina fosforilada es serina-810 o serina-67 de GEF-H1b de longitud completa expuesta en SEC ID Nº: 2. 40

19. Un procedimiento para identificar una sustancia que modula la interacción entre PAK4 y GEF-H1b que comprende (i) poner en contacto una sustancia candidata con un complejo de GEF-H1b-PAK4 y luego (ii) determinar si dicha sustancia perturba dicho complejo, en el que dicho GEF-H1b comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 2.

20. Un procedimiento para determinar la presencia de PAK4 activada en una muestra de células que comprende (i) 45 obtener el lisado celular de una muestra de células; (ii) aislar y/o separar proteínas de la preparación de lisado celular; y (iii) detectar la presencia de fosfovariantes de GEF-H1b, en el que GEF-H1b comprende la secuencia de aminoácidos

expuesta en SEC ID Nº: 2, y en el que la detección de que la serina-810 o la serina-67 de GEF-H1b está fosforilada indica que dicha muestra de células comprende PAK4 activada.

21. Un procedimiento para cribar un fármaco que inhibe la actividad de la cinasa PAK4 que comprende (i) obtener el lisado celular de una muestra de células, (ii) aplicar a dicho lisado un fármaco candidato; (iii) aislar y/o separar proteínas de dicha preparación de lisado celular; y (iv) detectar la presencia de fosfovariantes de GEF-H1b, en el que 5 GEF-H1b comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 2, y en el que la detección de que la serina-810 o la serina-67 de GEF-H1b está fosforilada indica que dicho fármaco no inhibe la actividad de la cinasa PAK4.

22. El procedimiento de cualquier reivindicación 20 ó 21, en el que dicha muestra de células es una muestra de células tumorales. 10

23. Un procedimiento in vitro para detectar proliferación celular, motilidad celular e/o invasión celular en un mamífero que comprende monitorizar en el momento de tiempo A y al menos otro momento de tiempo B el nivel de fosforilación de GEF-H1b en una muestra tomada de dicho mamífero, en el que un aumento en el nivel de fosforilación de GEF-H1b en dicha muestra entre dichos momentos de tiempo es indicativo de proliferación celular, motilidad celular y/o invasión celular, en el que dicho GEF-H1b comprende la secuencia de SEC ID Nº: 2. 15

24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que dicha muestra es una muestra de dicha piel, sangre o células de mamífero.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que dichas células son células tumorales.

26. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 23-25, en el que dicho mamífero se selecciona del grupo que consiste en un ser humano, rata, ratón, perro, conejo, cerdo, oveja, vaca, caballo, gato, primate, cabra o 20 mono.

27. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquier reivindicación 1 ó 2.

28. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 27.

29. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 21. 25

30. Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 21.

31. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 21.

32. Un procedimiento para identificar una molécula que perturba una interacción entre PAK4 y GEF-H1b que comprende: (a) exponer GEF-H1b a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 21, en el 30 que dicho polipéptido se une a dicho GEF-H1b para formar un complejo; (b) añadir una o más moléculas de prueba a dicho complejo; y (c) determinar si dicho polipéptido y dicho GEF-H1b se disocian el uno del otro después de añadir dicha(s) molécula(s) de prueba a dicho complejo.