Un procedimiento para seleccionar un mamífero susceptible al tratamiento con un modulador de la actividad de PAK4,

que comprende: (i) determinar la relación de PAK4 fosforilada a la proteína PAK4 total en una biopsia de ensayo de un tejido de un mamífero candidato; y (ii) comparar la relación de (i) con la relación de PAK4 fosforilada a la proteína PAK4 total en una biopsia de control que se obtiene del mismo tipo de tejido que la biopsia de ensayo del mamífero candidato, en el que el mamífero candidato es susceptible al tratamiento con un modulador de la actividad de PAK4 si la relación de PAK4 fosforilada a la proteína PAK4 total en la biopsia de ensayo es mayor que la de la biopsia de control

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de proteínas quinasas activadas por p21 fosforiladas (PAK) como biomarcadores de tumorogénesis, anticuerpos fosfoespecíficos para detectar PAK fosforilada de biopsias de mamíferos y ensayos de exploración para identificar compuestos que modulan la actividad de PAK. También se 5 contempla un procedimiento para determinar un subconjunto de una población dada que es susceptible al tratamiento con un compuesto que modula la actividad de PAK.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las proteína quinasa activada por p21 (PAK) serina/treonina quinasas son importantes efectores de las GTPasas de la familia Rho y se han implicado en la regulación de morfología y motilidad celular, así como en 10 transformación celular. Véase Callow y col., (2002), J. Biol. Chem., Vol. 277, Nº 1, 550-558.

Un miembro de esta familia de quinasas, PAK4, se sobreexpresa con frecuencia en líneas celulares tumorales humanas de diversos orígenes tisulares. La secuencia de aminoácidos de PAK4 comprende un sitio de autofosforilación en el dominio de quinasa de PAK4. La mutación de esta serina a ácido glutámico (S474E) da como resultado una activación constitutiva de la quinasa. Los anticuerpos fosfoespecíficos dirigidos contra serina 474 15 detectan PAK4 activada en la membrana del Golgi cuando PAK4 se co-expresa con Cdc42 activada. Además, la expresión del mutante de PAK4 activo (S474E) tiene potencial de transformación, lo que conduce a un crecimiento independiente de anclaje de las células NIH3T3. Una PAK4 inactivada por quinasa (K350A, K351A), por otro lado, bloquea de forma eficaz la transformación mediante Ras activado e inhibe el crecimiento independiente de anclaje de las células de cáncer de colon HCT116. Por lo tanto, PAK4 está fuertemente implicada en la transformación 20 oncogénica y sugiere que la actividad de PAK4 es necesaria para el crecimiento independiente de anclaje dirigido por Ras. Véase Callow y col. mencionado anteriormente.

Hasta la fecha, se han identificado seis PAK humanas. La primera subfamilia consiste en PAK1, PAK2 y PAK3, que muestran una identidad de secuencia del 80-90% dentro de sus dominios catalíticos. Los miembros de la segunda subfamilia de PAK recientemente identificada, PAK4, PAK5 y PAK6, también están altamente relacionados 25 entre sí pero muestran solamente 40-50% de identidad con los dominios quinasa de las PAK 1-3. Todos los miembros de la familia de PAK se caracterizan por la presencia de un dominio de unión p21, que se une a GTPasas de la familia Rho activadas (véase, Manser y col. (1994) Nature 367, 40-46; Bagrodia y col. (1995) J. Biol. Chem. 270, 22731-22737; Knaus y col., (1995) Science 269, 221-223; Martin y col., (1995) EMBO J. 14, 1970-1978; Teo y col., (1995) J. Biol. Chem. 270, 26690-26697; y Abo y col., (1998) EMBO J. 17, 6527-6540). 30

Como efectores de GTPasas de la familia Rho, las quinasas PAK desempeñan un papel importante en la regulación de la morfología y motilidad celular mediante la regulación del citoesqueleto de actina. Véase, Sells y col., (1997) Curr. Biol. 7, 202-210; Sells y col., (2000) J. Cell Biol. 151, 1449-1457; Haung y col., (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 7130-7138; Zhoa y col., (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 2153-2163; Edwards y col., (1999) Nature Cell Biol. 1, 253-259; y Kiosses y col., (1999) J. Cell Biol. 147, 831-844. Por ejemplo, la actividad de PAK se ha implicado en el ensamblaje 35 localizado en el borde anterior y desensamblaje en el borde posterior de las adhesiones focales durante la motilidad celular (Sells (1997), mencionado anteriormente; Frost y col., (1998) J. Biol. Chem. 273, 28191-28198; y Eby y col., (1998) Curr. Biol. 8, 967-970). Durante la curación de heridas de monocapas de fibroblastos, la PAK1 activada se sitúa rápidamente en el borde anterior desde las células móviles (Sells y col. (2000) mencionado anteriormente). Además, se ha demostrado que la sobreexpresión de PAK4 induce polimerización de actina localizada y formación 40 de filopodios (Abo y col., (1998) mencionado anteriormente). Los cambios dependientes de PAK4 en el citoesqueleto de actina son dependientes de la actividad quinasa de PAK4 y localización dependiente de Cdc42 en la membrana del Golgi. La capacidad de las PAK para modular el citoesqueleto de actina se debe a mecanismos dependientes e independientes de quinasa.

Qu y col., ((2001) Molecular and Cellular Biology 21 (10), 3523 - 3533) sugieren que PAK4 es un mediador 45 esencial en el crecimiento independiente de anclaje inducido por Cdc42 y factores de intercambio de la familia Dbl.

Puesto que PAK4 es un efector de Cdc42, se asocia con más probabilidad con quimiotaxis, adhesión celular, respuestas inflamatorias y actividades inmunológicas innatas. Por ejemplo, existen pruebas crecientes que implican a las quinasas PAK en crecimiento independiente de anclaje dirigido por Ras oncogénico y en la regulación de supervivencia celular. Véase, por ejemplo, Qiu y col., (1995) Nature 374, 457-459; Qiu y col., (1995) Proc. Natl. 50 Acad. Sci. U. S. A. 92, 11781-11785; Qiu y col., (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 3449-3458; Khosravi-Far y col., (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 6443-6453; Prendergast y col., (1995) Oncogene 10, 2289-2296; Keely y col., (1997) Nature 390, 632-636; Tang y col., (1997) Mol. Cell. Biol. 17, 4454-4464; Tang y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci 95, 5139-5144; Tang y col., (2000) J. Biol. Chem. 275, 9106-9109; Osada y col., (1997) FEBS Lett. 404, 227-233; y Lin y col. (1999) J. Biol. Chem. 274, 23633-23641. 55

Sin embargo, no hay ninguna sugerencia en la técnica anterior para usar PAK4 fosforilada como un biomarcador para tumorogénesis en muestras de biopsia obtenidas de mamíferos sanos y enfermos. De forma similar, no existe ninguna sugerencia para el uso de anticuerpos fosfoespecíficos de PAK4 para determinar el efecto de una composición terapéutica en un mamífero sometido a tratamiento. De forma similar, la técnica no dice nada al

respecto del uso de ensayos de exploración de fosforilación de PAK4 para identificar compuestos que son útiles como moduladores de la actividad de PAK. Tampoco existen enseñanzas en la técnica anterior para la detección y comparación de niveles de fosforilación de PAK como un medio para identificar subconjuntos de una población dada que son susceptibles al tratamiento con moduladores de la actividad de PAK.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN 5

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para seleccionar un mamífero susceptible al tratamiento con un modulador de la actividad de PAK. Este procedimiento comprende (i) determinar la relación de PAK4 fosforilada con proteína PAK total en una biopsia de ensayo de un tejido de un mamífero candidato; y (ii) comparar la relación de (i) con la relación de PAK4 fosforilada con proteína PAK total en una biopsia de control que se obtiene del mismo tipo de tejido que la biopsia de ensayo del mamífero candidato. En una realización 10 preferida, el mamífero candidato es susceptible al tratamiento con un modulador de la actividad de PAK4 si la relación de PAK4 fosforilada con proteína PAK total en la biopsia de ensayo es mayor que la de la biopsia de control.

En otra realización, la biopsia de control se obtiene de un mamífero sano de la misma especie que el mamífero candidato. En otra realización más, el mamífero candidato comprende una célula cancerosa. En otra realización, el mamífero candidato tiene un tumor. 15

Algunas realizaciones de la divulgación se refieren al uso de una PAK distinta de PAK4. Sin embargo, la invención reivindicada se limita a procedimientos que implican PAK4.

La divulgación también proporciona un procedimiento para controlar el efecto de una composición terapéutica en un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende (i) medir un primer nivel de fosforilación de PAK en una primera biopsia obtenida del mamífero antes de la administración de una composición terapéutica al 20 mamífero; y (ii) medir un segundo nivel de fosforilación de PAK en una biopsia posterior obtenida del mamífero después de la administración de la composición terapéutica. De acuerdo con el procedimiento, un menor nivel de fosforilación de PAK en la biopsia posterior en comparación con la primera biopsia es indicativo de un efecto de la composición terapéutica del mamífero.

El procedimiento también contempla en una realización, que ambas o una de las biopsias son sospechosas 25 de contener células capaces de crecimiento celular independiente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para seleccionar un mamífero susceptible al tratamiento con un modulador de la actividad de PAK4, que comprende:

(i) determinar la relación de PAK4 fosforilada a la proteína PAK4 total en una biopsia de ensayo de un tejido de un mamífero candidato; y

(ii) comparar la relación de (i) con la relación de PAK4 fosforilada a la proteína PAK4 total en una biopsia de 5 control que se obtiene del mismo tipo de tejido que la biopsia de ensayo del mamífero candidato,

en el que el mamífero candidato es susceptible al tratamiento con un modulador de la actividad de PAK4 si la relación de PAK4 fosforilada a la proteína PAK4 total en la biopsia de ensayo es mayor que la de la biopsia de control.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la biopsia de control se obtiene de un mamífero sano de la 10 misma especie que el mamífero candidato.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el mamífero candidato comprende una célula cancerosa.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el mamífero candidato tiene un tumor.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el mamífero candidato se selecciona del grupo que consiste en un ser humano, rata, ratón, cerdo, vaca, cabra, mono, gato y perro. 15

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el mamífero es un ser humano.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el nivel de PAK4 fosforilada se determina usando un anticuerpo fosfoespecífico específico para la serina fosforilada de PAK4.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el anticuerpo fosfoespecífico se induce contra el péptido de PAK4, RRKSLVGTPY-WMAPE (SEC ID Nº: 1), que comprende una serina fosforilada. 20

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el nivel de proteína PAK4 total se determina usando un anticuerpo específico para PAK4.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo específico de PAK4 se induce contra la secuencia peptídica ATTARGGPG-KAGSRGRFAGHSEA (SEC ID Nº: 2).