Derivados de bis-benzamidinios y su uso como agentes de reconocimiento de secuencias de ADN.

La presente invención se refiere a un grupo de compuestos derivados de la pentamidina, que comprenden grupos 4-aminobenzamidinios en su estructura, y a su procedimiento de síntesis. Esta estructura les permite unirse al surco menor del ADN lo que hace que sean idóneos para su uso como agentes fluorogénicos de reconocimiento de secuencias de ADN

Derivados de bis-benzamidinios y su uso como agentes de reconocimiento de secuencias de ADN.

La presente invención se refiere a un grupo de compuestos derivados de la pentamidina, a su procedimiento de síntesis y a su uso como agentes fluorogénicos de reconocimiento de secuencias de ADN.

Estado de la técnica anterior

Un importante objetivo de las investigaciones actuales en la frontera entre la química y la biología es el desarrollo de agentes químicos capaces de interaccionar de forma eficiente con secuencias específicas de ADN de doble cadena. A lo largo de las últimas décadas se han descrito un gran número de agentes heterocíclicos capaces de unirse selectivamente al ADN insertándose en su surco menor (cfr. Lown, J. W. Pharmacol. Ther. 1999, 84, 1-111). Entre estas moléculas, probablemente las más estudiadas sean aquellas basadas en poliamidas de pirrol e imidazol en estructura de horquilla β, puesto que muestran unas propiedades excelentes en cuanto a afinidad y especificidad de secuencia. Desafortunadamente la síntesis de estos compuestos no es precisamente trivial, y su utilidad in vivo está en gran medida limitada debido a dificultades intrínsecas para atravesar membranas biológicas y notable toxicidad.

Otro tipo de agentes que también reconocen el surco menor del ADN son los compuestos de tipo bis-bencilamidinio, tales como la pentamidina o propamidina. Estas moléculas son especialmente atractivas desde el punto de vista farmacológico, puesto que son estables y presentan buenas propiedades de transporte en numerosas líneas celulares. Así por ejemplo, la pentamidina esta siendo utilizada desde hace años contra la tripanosomiasis, la leismaniasis y neumonía de P. Carinii. De entre los derivados de bis-amidinas son también especialmente importantes aquellos con conectores de tipo aromático, de hecho la DB289, una prodroga de la furamidina, se encuentra en fase clínica III contra la enfermedad del sueño, y es muy activa contra otros parásitos (cfr. Mathis, A. M., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 51, 2801-2810).

Estas propiedades, junto con su simplicidad estructural, han animado la búsqueda de nuevos análogos con propiedades de reconocimiento mejoradas y toxicidades reducidas. En estos momentos, las mayores limitaciones para el desarrollo de este tipo de benzamidinios tienen que ver con la escasa versatilidad y practicidad de las rutas sintéticas existentes y con el hecho de que no exista un método simple, rápido y fiable que permita evaluar y cuantificar su afinidad y selectividad por secuencias específicas del ADN. El método habitual para estudiar la afinidad de este tipo de moléculas se basa en la desnaturalización térmica de sus complejos con el ADN. Sin embargo, este método sólo da información indirecta y bastante cualitativa de las características de reconocimiento de estos compuestos, y además es difícil de implementar en estrategias de high-throughput screening.

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención han observado que sustituyendo las unidades de bis-4-fenoxiamidinio, características de los derivados clásicos de tipo benzamidínico, por 4-aminobenzamidinios se obtienen análogos que poseen una estructura adecuada para interaccionar con secuencias de ADN ricas en A/T, con la ventaja adicional de que exhiben fluorescencia cuando interaccionan con dicho ADN de doble cadena.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) (a partir de ahora compuestos de la invención):

donde: R₁ se selecciona entre B(OH)₂, N₃, y X es N o CH.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto como descrito anteriormente, donde los sustituyentes del anillo central del conector se encuentran en posición meta o para. En una realización más preferida, los grupos bencilamidinio se encuentran en posición para.

En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto como descrito anteriormente donde X es CH.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los compuestos de la invención que comprende una aminación reductiva de la 4-aminobenciimidamida en presencia de aldehído de fórmula CHO-X'-CHO, donde X' es un grupo con la siguiente estructura:

Se ha desarrollado un nuevo método sintético que permite obtener de una forma versátil una variedad de análogos de pentamidina con sistemas aromáticos en la cadena de unión entre las unidades de aminobenzilamidinio.

El método consiste en una única etapa, y conlleva una aminación reductiva entre el reactivo comercial 4-aminobencenocarboxiamidina y una selección de dialdehídos también comercialmente disponibles. Este proceso se muestra de forma general en el siguiente esquema:

Esquema 1

Estrategia sintética general de afinación reductiva de 4-aminobenzimidamida

En un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto de la invención como agente flurogénico de reconocimiento de secuencias de ADN. Preferiblemente, la secuencia de ADN que reconoce dicho agente fluorogénico está formada por 6 pares de bases A/T.

En la presente invención, el término "agente fluorogénico" se refiere a una molécula fluorescente que posee un grupo funcional que absorbe energía de una longitud de onda específica y la emite en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir, con menor energía). La cantidad de energía emitida y su longitud de onda dependen tanto del propio grupo funcional fluorescente como de su ambiente químico.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Figuras

Figura 1. Emisión de fluorescencia de diversos compuestos aromáticos en presencia de concentraciones crecientes el ADN AAATTT. Compuesto 1 (R₁ = B(OH)₂, X = CH, círculos blancos); Compuesto 2 (R₁ = N₃, X = CH, triángulos negros); conector m-fenilo (R₁ = H, X = CH, rombos negros); conector p-fenilo (R₁ = H, X = CH, rombos blancos); derivado de piridina (R₁ = H, X = N, círculos negros).

Ejemplos

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y efectividad de los compuestos de fórmula (I) de la presente invención con las siguientes fórmulas:

La síntesis del compuesto de la presente invención conteniendo el sustituyente B(OH)₂ se llevó a cabo utilizando el procedimiento descrito anteriormente (Esquema 1).

En un balón purgado y flameado se mezcló ácido 3,5-diformilfenil borónico (200 mg 1.12 mmol), dihidrocloruro de p-anilinbezanamida (0.443 mg 2.2 mmol) y cianoborohidruro sódico (154 mg 2.24 mmol l). A continuación se añadieron 25 ml de MeOH y se dejó reaccionar durante 7 horas a temperatura ambiente. Transcurrido ese tiempo se concentra el crudo de reacción a presión reducida y el residuo se purifica por cromatografía de media presión en fase reversa (Büchi Sepacore Flash de fase reversa (C-18) con gradiente de acetonitrilo/agua 0.1% TFA). La identidad de los productos finales se confirmó por MS (ESI) y RMN (1H, 13C, DEPT).

El compuesto conteniendo la azida (2) se sintetizó a partir del compuesto 1...

1. Compuesto de fórmula (I)

donde:

R¹ se selecciona entre, B(OH)₂ ó N₃; y

X se selecciona entre N o -CH-.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición orto o para.

3. Compuesto según la reivindicación 2, donde los grupos 4-aminobenzamidinio se encuentran en posición para.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde X es CH.

5. Procedimiento de obtención de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la aminación reductiva del compuesto 4-aminobenciimidamida en presencia de un aldehido de fórmula CHO-X'-CHO, donde X' es un grupo con la siguiente estructura:

donde R₁ y X se definen como en la reivindicación 1.

6. Uso de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como agente fluorogénico de reconocimiento de secuencias de ADN.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que la secuencia de ADN que se reconoce está formada por 6 pares de bases A/T.