ANTICUERPOS FRENTE A KDR, SU PRODUCCIÓN Y USOS.

Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para KDR humano,

que comprende una región variable de la cadena pesada del SEQ ID NO: 15 y una región variable de la cadena ligera del SEQ ID NO: 16

Anticuerpos frente a KDR, su producción y usos.

La presente invención se refiere a una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para determinantes antigénicos del receptor con dominios de inserción de quinasa humana (KDR). La molécula de anticuerpo se une a KDR con mayor afinidad que el factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF) y evita la interacción entre VEGF y KDR. La presente invención se refiere también a los usos terapéuticos de la molécula de anticuerpo y a métodos para producir la molécula de anticuerpo.

Esta invención se refiere a moléculas de anticuerpo. En una molécula de un anticuerpo, hay dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada y cada cadena ligera tienen en su extremo N-terminal un dominio variable. Cada dominio variable se compone de cuatro regiones marco (FR) que se alternan con tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las CDR determinan la especificidad de unión al antígeno de los anticuerpos y son secuencias peptídicas relativamente cortas mantenidas sobre las regiones marco de los dominios variables. Los residuos de los dominios variables se numeran convencionalmente según un sistema creado por Kabat et al. Este sistema está descrito por Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (de aquí en adelante "Kabat et al. (cita anterior)"). Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva excepto cuando se indica otra cosa.

Las designaciones de los residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que los de la numeración estricta de Kabat que corresponde a un acortamiento de un componente estructural o a una inserción en un componente estructural, ya sea marco o CDR, de la estructura del dominio variable básico. La numeración correcta de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineamiento de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat.

Las CDR del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1), residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) según la numeración de Kabat.

Las CDR del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1), residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) según la numeración de Kabat.

La construcción de anticuerpos injertados con CDR se describe en la solicitud de patente europea EP-A-0239400, que describe un procedimiento en el que las CDR de un anticuerpo monoclonal de ratón se injertan en las regiones marco de los dominios variables de una inmunoglobulina humana mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando oligonucleótidos largos.

El primer trabajo sobre anticuerpos monoclonales humanizados por injertos de CDR se llevó a cabo sobre anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos sintéticos, tales como NP. Sin embargo, ejemplos en los que un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la lisozima y un anticuerpo monoclonal de rata que reconoce un antígeno sobre las células T humanas fueron humanizados por injertos de CDR, han sido descritos por Verhoeyen et al. (Science, 239, 1534-1536, 1988) y Riechmann et al. (Nature, 332, 323-324, 1988), respectivamente.

Riechmann et al., encontraron que la transferencia de las CDR solas (como han sido definidas por Kabat (Kabat et al. (cita anterior) y Wu et al., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) no fue suficiente para proporcionar una actividad satisfactoria de unión al antígeno en el producto injertado con CDR. Se encontró que muchos residuos marco tenían que ser alterados para que se correspondieran con los de la región marco del donante. Los criterios propuestos para seleccionar qué residuos marco necesitan ser alterados están descritos en la solicitud de patente internacional No. WO 90/07861.

Se han publicado una serie de reseñas que exponen los anticuerpos injertados con CDR, incluyendo Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

VEGF es una glicoproteína homodimérica de dos subunidades de 23kD con similitud estructural con PDGF. Tiene un importante papel evolutivo en la vasculogénesis, el establecimiento de un sistema de nuevos vasos sanguíneos, y está implicado en la angiogénesis, la formación de nuevos vasos a partir de los ya existentes. La angiogénesis implica la proliferación, migración e infiltración tisular de células endoteliales capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Además de jugar un importante papel en los procesos fisiológicos normales, tales como el desarrollo embrionario, el crecimiento folicular (incluyendo la formación del cuerpo lúteo) y la curación de heridas, la angiogénesis se produce en numerosas condiciones patológicas incluyendo la inflamación, la psoriasis, la artritis reumatoide y el crecimiento y la metástasis tumoral (Folkman, J and Klagsbrun, M., Science, 235:442-447, 1987). Por ejemplo, se cree generalmente que los tumores son incapaces de crecer más allá de cierto tamaño a menos que estén provistos de un suministro de sangre entregado por medio de angiogénesis.

El VEGF es distinto de otros factores implicados como posibles reguladores de la angiogénesis in vivo ya que es un inductor de la angiogénesis específico de las células endoteliales.

Existen cinco isoformas monoméricas diferentes de VEGF, resultantes del empalme alternativo del ARNm. Las isoformas incluyen dos formas unidas a membrana (VEGF₂₀₆ y VEGF₁₈₉) y tres formas solubles (VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁ y VEGF₁₄₅). En todos los tejidos excepto en placenta humana, el VEGF₁₆₅ es la isoforma más abundante.

Los efectos de VEGF están mediados por su interacción con dos receptores tirosina quinasa de alta afinidad, receptor tirosina quinasa de tipo fms (FLT-1 o VEGFR-1, Shibuya M. et al., Oncogene, 5 519-524, 1990) y KDR (o VEGFR-2, Terman et al., Oncogene, 6, 1677-1683, 1991). Tanto KDR como FLT-1 son receptores que abarcan la membrana que contienen cada uno siete dominios de tipo inmunoglobulina en la región de unión al ligando extracelular, un dominio tirosina quinasa intracelular y un dominio transmembrana. El dominio transmembrana sirve para anclar el receptor en la membrana celular de las células en las cuales es expresado.

Existen varios informes de la expresión en exceso tanto de VEGF como de sus receptores en los tumores, tanto a nivel de ARN como de proteína (Dvorak et al., Curr. Top. Microbiol. Imunol., 237, 97, 1999). La expresión de VEGF está regulada al alza en respuesta a la hipoxia, que se produce frecuentemente en los tumores, y el aumento de concentración de ligando induce la expresión de sus receptores. Los ejemplos de los estudios que muestran un aumento de la expresión de KDR en tumores humanos incluyen: cáncer de mama (Brown et al., Hum. Pathol., 26, 86, 1995); cáncer de colon (Takahashi et al., Cancer Res., 55, 3964, 1995); cáncer renal (Takahashi et al, BBRC 257, 855, 1999) y adenocarcinoma del tracto gastrointestinal (Brown et al., Cancer Res., 53, 4727, 1993). En un estudio más reciente en el que se utiliza un anticuerpo que reconoce específicamente VEGF unido a KDR, se observó la regulación al alza de la ruta angiogénica de VEGF/KDR en un cáncer de pulmón de células no pequeñas (Koukourakis et al., Cancer Res., 60, 3088, 2000).

Numerosas evidencias experimentales demuestran la conexión causal entre la actividad de VEGF y la angiogénesis tumoral in vivo. Kim et al. inyectaron un anticuerpo monoclonal neutralizador anti-VEGF en ratones carentes de sistema inmunitario que portaban tumores y mostraron una supresión del crecimiento tumoral (Nature 362, 841, 1993). La expresión retroviral de una KDR de ratón negativa dominante (FLK-1) también inhibió el crecimiento tumoral en ratones (Millauer et al., Nature, 367, 576, 1993). De un modo similar, el VEGF antisentido (Cheng et al., PNAS, 93, 8502, 1996), y los anticuerpos anti-FLK-1 (Witte et al., Cancer Metast. Rev., 17, 155, 1998) y la expresión de FLT-1 soluble (Goldman et al., PNAS, 95, 8795, 1998) inhibieron todos el crecimiento de tumores en modelos de ratón.

1. Una molécula de anticuerpo que tiene especificidad para KDR humano, que comprende una región variable de la cadena pesada del SEQ ID NO: 15 y una región variable de la cadena ligera del SEQ ID NO: 16.

2. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en los aminoácidos 22 a 235 del SEQ ID NO: 11.

3. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en el SEQ ID NO: 57.

4. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en los aminoácidos 22 a 235 del SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada que comprende la secuencia dada en el SEQ ID NO: 57.

5. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 1, que es un fragmento Fab modificado que tiene en el extremo C terminal de su cadena pesada uno o más aminoácidos que forman una región bisagra modificada que contiene uno o dos residuos de cisteína a los cuales puede ser anclada una molécula efectora o indicadora.

6. La molécula de anticuerpo de la reivindicación 5, que es un fragmento Fab modificado que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia dada en los aminoácidos 22 a 235 del SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada que tiene la secuencia dada en los aminoácidos 22 a 249 del SEQ ID NO: 12.

7. Un compuesto que comprende la molécula de anticuerpo de la reivindicación 5 que tiene anclado covalentemente a un residuo de cisteína de la región bisagra modificada una molécula efectora o indicadora.

8. El compuesto de la reivindicación 7, donde la molécula efectora comprende uno o más polímeros.

9. El compuesto de la reivindicación 8, donde el uno o más polímeros es/son un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado.

10. El compuesto de la reivindicación 9, donde el uno o más polímeros es/son un metoxipoli(etilenglicol).

11. El compuesto de la reivindicación 7 que comprende la molécula de anticuerpo de la reivindicación 5 que tiene anclado a uno de los residuos de cisteína en el extremo C-terminal de la cadena pesada un grupo lisil-maleimida o lisil bis-maleimida donde cada grupo amino del residuo lisilo tiene unido covalentemente a él un residuo de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

12. Un compuesto que comprende la molécula de anticuerpo de la reivindicación 5, que es un di(Fab modificado) PEGilado en el que cada Fab modificado comprende una cadena ligera que tiene la secuencia dada en los aminoácidos 22 a 235 del SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada que tiene la secuencia dada en los aminoácidos 22 a 249 del SEQ ID NO: 12.

13. El di-(Fab modificado) PEGilado de la reivindicación 12, que comprende al menos una molécula de mPEG.

14. El di(Fab modificado) PEGilado de la reivindicación 13, donde cada mPEG está unido a un residuo de lisina anclado covalentemente a un conector de bis-maleimida.

15. El di(Fab modificado) PEGilado de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, donde cada molécula de mPEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da.

16. Secuencias de ADN que codifican la cadena pesada y ligera de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

17. Un vector de clonación o expresión que contiene las secuencias de ADN de la reivindicación 16.

18. Un vector de expresión de E. coli que comprende las secuencias de ADN de la reivindicación 16.

19. El vector de expresión de E. coli de la reivindicación 18 que es pTTOD(CDP791).

20. Una célula anfitriona transformada con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.

21. Un procedimiento para la producción de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 20 y aislar la molécula de anticuerpo.

22. Un procedimiento para la producción de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende cultivar E. coli que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19 y aislar la molécula de anticuerpo.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, donde la molécula de anticuerpo es dirigida al periplasma.

24. Una composición terapéutica o para diagnóstico, que comprende la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15.

25. La molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene especificidad para KDR humano, o el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, para su uso en el tratamiento de una patología en la cual están implicados VEGF y/o KDR.

26. La molécula de anticuerpo o el compuesto de la reivindicación 25, para su uso en el tratamiento de la inflamación, la psoriasis, la artritis reumatoide y crecimiento o la metástasis de tumores.

27. El uso de la molécula de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene especificidad para KDR humano, o el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología en la cual están implicados VEGF y/o KDR.

28. El uso de la reivindicación 27, donde la patología es la inflamación, la psoriasis, la artritis reumatoide y el crecimiento o la metástasis tumoral.