Un método para la detección cualitativa o cuantitativa de células T CD4+ específicas de antígeno y/o Células T CD8+ en un sujeto,

dicho método comprende detectar cualitativamente o cuantitativamente la coexpresión del marcador CD25 de superficie celular y uno o más de los marcadores de superficie celular CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ en una muestra de sangre completa de dicho sujeto luego de la exposición in vitro de la muestra de sangre completa a un antígeno

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con métodos para la detección de células T CD4+ o CD8+ específicas de antígeno o la medición de la inmunocompetencia general de un sujeto.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN

La subpoblación CD4+ de linfocitos T (células T CD4+) juega un papel principal en la defensa del cuerpo contra patógenos intracelulares tal como bacterias intracelulares patogénicas (por ejemplo Micobacterias) y hongos (por ejemplo Candida), virus y protozoarios. En particular, las células T CD4+ ayudan a regular la respuesta inmune mediada por célula a la infección mediante tales patógenos intracelulares, y de hecho se refieren frecuentemente a células T "auxiliares", al promover una variedad de respuestas inmunes de otras células (por ejemplo promoción y maduración de linfocitos B y respuestas de anticuerpo, activación de macrófagos, y mejoramiento de linfocitos citolíticos naturales (NK) y actividad de célula T citotóxica CD8+ (CTL)) a través de la liberación de citoquinas en respuesta a la estimulación antigénica. Tal estimulación antigénica se logra mediante el reconocimiento por células T CD4+ "cebadas" (es decir células T CD4+ que se han expuesto previamente a un antígeno para llegar a ser "células T CD4+ específicas de antígeno") de un antígeno presentado por cualquier antígeno que presenta la expresión celular de una proteína (MHC) de complejo de histocompatibilidad principal clase II apropiada. Como se mencionó anteriormente, una de las respuestas inmunes, o "funciones efectoras", provocada mediante las células T CD4+ estimuladas es la activación de macrófagos. Los macrófagos activados tienen una función vital en patógenos asesinos en los sitios de infección a través de la actividad patogénica incrementada (es decir los macrófagos activados muestran una capacidad incrementada para fagocitar patógenos) y otras actividades. La interacción entre células T CD4+ específicas de antígeno y macrófagos forman la base de la denominada respuesta de hipersensibilidad del tipo tardía (DTH) que se ha explotado en varias pruebas de piel para determinar si se ha expuesto previamente un sujeto o "sensibilizado" a un antígeno particular (por ejemplo un antígeno de un patógeno o un alérgeno). Un tipo bien conocido de prueba de piel DTH es la prueba Mantoux que emplea tuberculina como un antígeno en la prueba para tuberculosis latente (originada por tuberculosis Micobacterium) en un sujeto o para determinar si un sujeto se ha vacunado previamente con vacuna de tuberculosis Calmette-Guerin bacille (BCG).

La prueba Mantoux, y otras pruebas de hipersensibilidad de piel del tipo tardío similares tal como la Multiprueba BioMerieux, se han utilizado ampliamente en los laboratorios de investigación diagnóstica y clínica para detectar respuestas específicas de antígeno, mediadas presuntamente por células T CD4+. Ellos, sin embargo, requieren una cantidad considerable de tiempo para desarrollar (es decir con el fin de alcanzar un resultado legible), requieren que el paciente regrese para la lectura del resultado, y existe considerable variabilidad de intraoperador en la aplicación y lectura de estas pruebas. Estos problemas combinan limitar su uso efectivo. Por ejemplo, para la prueba Mantoux, se puede observar cualquier respuesta DTH algunos 2 -3 días después de la administración del antígeno de tuberculina, que no puede ser factible o deseable para la prueba efectiva de personas vivas en ubicaciones remotas. Más aún, la evaluación de los resultados de prueba de piel es relativamente subjetiva, conduciendo a resultados cualitativos más que a resultados cuantitativos.

Aparte de las pruebas de piel DTH, se pueden detectar células T CD4+ específicas de antígeno, y de hecho se miden, mediante otros métodos. Por ejemplo, utilizando células mononucleares de sangre periférica (PBMC), las células T CD4+ específicas de antígeno se pueden medir por el método conocido como ensayo de linfoproliferación (LPA). Sin embargo, este método, que utiliza la capacidad de proliferación de las células T CD4+ in vitro e involucra detectar la incorporación de 3H-timidina en ADN nuevamente sintetizado después de 6 -7 días en cultivo, tiene varias limitaciones haciéndolo poco atractivo para laboratorios de diagnóstico, a saber: (i) el uso de altos niveles de radionucleótidos; (ii) un tiempo largo de "cambio"; (iii) el requerimiento para procesamiento largo de muestras de sangre para preparar PBMC; (iv) la dependencia de suero humano cuidadosamente seleccionado, con variabilidad de tanda a tanda; (v) la necesidad de técnicas de cultivo que requieren un alto nivel de entrenamiento; (vi) el hecho que la respuesta solo se pueda atribuir a células T CD4+ si las células T CD4+ se purifican primero; y vii) la variabilidad intra e interensayo sustancial hace la estandarización entre la problemática de los laboratorios. Actualmente, los LPA se desarrollan raramente excepto en laboratorios de investigación.

Otro ejemplo es una versión de citometría de flujo del LPA, utilizando diacetato de carboxifluoresceína, éster succimidilo (CFSE)-marcado PBMC (1). Este ensayo es utilizado ampliamente en laboratorios de investigación, y aunque este tiene distintas ventajas que no utilizan radioactividad y también permite la identificación directa para responder a células T CD4+, esto todavía sufre de otras desventajas de LPA. Adicionalmente, este ensayo tiene la desventaja que el análisis de citometría de flujo se pueden desarrollar muy cuidadosamente ya que el número de células relevantes puede ser muy bajo, frecuentemente en medio de teñido sustancial de fondo.

Un ejemplo adicional es el denominado ensayo de citoquina intracelular (ICC). Esto se llega a utilizar relativamente ampliamente en laboratorios de investigación, y permite la detección directa de las células T CD4+ específicas de antígeno en cultivos de sangre completa (2). Este ensayo tiene, sin embargo, un trabajo bastante intensivo; requiere un cultivo de 6 horas con antígenos de proteína completa (2 horas para procesamiento y presentación de antígeno, más 4 horas con brefeldian A) o cultivo de 6 horas con péptidos y brefeldina A. Adicionalmente, cuando se obtienen muestras en la tarde, ellas requieren etapa de procesamiento en la noche, o de otra forma se dejan hasta el siguiente día, lo que no es óptimo. Más aún, luego se requiere después de cultivo una etapa de teñido intracelular de 2 horas, seguido por análisis citométrico de flujo. Automatización del ensayo ICC es posible (3), pero no generalmente disponible. También, es problemática la estandarización entre los laboratorios.

De acuerdo con lo anterior, no hay método para detectar células T CD4+ específicas de antígeno entre aquellas que están actualmente disponibles que son fácilmente aplicables a los laboratorios de investigación, diagnósticos y clínicos. Adicionalmente, de aquellos que son adecuados para uso en laboratorios diagnósticos, varios problemas y dificultades con ellos los han hecho impopulares. Sin embargo, los ensayos para detectar células T CD4+ específicas de antígeno no son solo el tipo de ensayo de respuesta inmune que ha carecido del favor de los laboratorios de diagnóstico. Es decir, la respuesta de los linfocitos del sistema inmune al mitógeno policlonal, ha utilizado ampliamente fitohemaglutinina (PHA), como una medición de inmunocompetencia de célula T general (por ejemplo para casos de inmunodeficiencia primaria sospechada (4)); sin embargo, debido a que este ensayo se basa en LPA de 3H-timidina, con la excepción que las células se cosechan en el día 3, este tiene esencialmente el objeto de la misma desventaja que el LPA.

Se ha propuesto un método de sangre completa más simple en las que alícuotas pequeñas de muestras anti-coaguladas de sangre completa se incuban con un antígeno o PHA durante 4 horas (hasta 24 horas), y activación medida por la regulación por aumento del antígeno marcador de activación de célula T temprana, CD69, en células T CD4+, mediante citometría de flujo (5). Este ensayo de sangre completa, con un corto tiempo de cambio y lectura de superficie celular muy simple, es un método atractivo. Sin embargo, en manos del actual solicitante, se ha encontrado que aunque el ensayo es útil para medir las respuestas PHA policlonales, no es suficientemente específico para detectar células T CD4+ específicas de antígeno ya que un número mayor no viable de células T CD4+ regulan por aumento el CD69 en respuesta a antígeno indicando una carencia de especificidad con esta lectura. Adicionalmente,...

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1. Un método para la detección cualitativa o cuantitativa de células T CD4+ específicas de antígeno y/o Células T CD8+ en un sujeto, dicho método comprende detectar cualitativamente o cuantitativamente la coexpresión del marcador CD25 de superficie celular y uno o más de los marcadores de superficie celular CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ en una muestra de sangre completa de dicho sujeto luego de la exposición in vitro de la muestra de sangre completa a un antígeno.

2. El método de la reivindicación 1 que comprende las siguientes etapas:

(i) cultivar la muestra de sangre completa del sujeto en la presencia del antígeno; y

(ii) detectar cualitativamente o cuantitativamente la coexpresión de CD25 y uno o más de CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ en la muestra de sangre completa cultivada.

3. Un método para medir la inmunocompetencia de un sujeto, dicho método comprende detectar cualitativamente o cuantitativamente la coexpresión del marcador CD25 de superficie celular y uno o más de los marcadores de superficie celular CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ en una muestra de sangre completa de dicho sujeto luego de la exposición in vitro de la muestra de sangre completa a un antígeno y/o mitógeno.

4. El método de la reivindicación 3 que comprende las siguientes etapas:

(i) cultivar la muestra de sangre completa del sujeto en la presencia del antígeno y/o mitógeno; y

(ii) detectar cualitativamente o cuantitativamente la coexpresión de CD25 y uno o más de CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ en la muestra de sangre completa cultivada.

5. El método de la reivindicación 4 en donde dicha etapa de cultivo consiste de cultivar la muestra de sangre completa en la presencia del antígeno.

6. El método de las reivindicaciones 1 a 5 en donde el antígeno se selecciona del grupo que consiste de tuberculina, antígeno de núcleo del Virus de Hepatitis C (HCV), proteína 3 no estructural HCV (NS3), lisato de citomegalovirus (CMV), Fosfoproteína 65 CMV (pp65), Lisato (HSV)-1 del Virus Herpes Simplex, lisato HSV-2, lisato vaccinia, derivado de tétano toxoide (proteína purificada, TT) (PPD) de tuberculosis Micobacterium, Estreptoquinasa de antígeno estreptococcus, Virs de Inmunodeficiencia Humana (VIH)-1 p24, y grupos de péptidos traslapantes de HN-1 Gag, Env, Pol u otras proteínas accesorias.

7. El método de la reivindicación 4 en donde dicha etapa de cultivar consiste de cultivar la muestra de sangre completa en la presencia del mitógeno.

8. El método de la reivindicación 2 o 4 en donde la etapa de detección se desarrolla dentro de aproximadamente 24 a 48 horas desde el inicio de la etapa de cultivo.

9. El método de la reivindicación 8 en donde la etapa de detección se desarrolla dentro de aproximadamente 40 a 44 horas desde el inicio de la etapa de cultivo.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la etapa de detectar la coexpresión de CD25 y uno o más de CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ consiste en detectar cualitativamente o cuantitativamente CD25 y CD134 en células T CD4+.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la etapa de detectar la coexpresión de CD25 y uno o más de CD134 y CD137 mediante una célula T CD4+ y/o una célula T CD8+ consiste de detectar cualitativamente o cuantitativamente CD25 y CD137 en células T CD8+.

5 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde la etapa de detección comprende el uso de por lo menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo de anticuerpos monoclonales que unen específicamente a uno de CD25, CD134 y CD137.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde el método comprende adicionalmente una etapa de aislar células que coexpresan CD25 y uno o más de CD134 y CD137.

14. El método de la reivindicación 13 en donde la etapa de aislamiento comprende el uso de por lo menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo de anticuerpos monoclonales que unen específicamente a uno de CD25, CD134 y CD137.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en donde el sujeto es humano.