ENSAYO PARA IDENTIFICAR CÉLULAS PRODUCTORAS DE ANTICUERPOS.

Un ensayo homogéneo in vitro para identificar una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado que comprende:

a) proporcionar una población de células productoras de anticuerpos; b) incubar sobre un portaobjetos de microscopio dicha población de células productoras de anticuerpos con un antígeno seleccionado conjugado con una perla o acoplado a un eritrocito, o antígeno expresado sobre la superficie de un célula, y un anticuerpo anti-anticuerpo marcado, en el que dicho anticuerpo anti-anticuerpo puede distinguir células que producen un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado de las células que no lo hacen y en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado se marca con un conjugado fluorescente; y c) sin necesidad de retirar anticuerpos anti-anticuerpo marcados no unidos, identificar una célula productora de anticuerpos capaz de producir un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado detectando el incremento en la concentración de anticuerpos anti-anticuerpo marcados que rodean la célula usando un microscopio

Ensayo para identificar células productoras de anticuerpos La presente invención se refiere, en general, a procedimientos mejorados para producir anticuerpos y más específicamente proporciona un ensayo homogéneo para obtener anticuerpos.

El procedimiento de anticuerpos de linfocitos seleccionados (SLAM) para generar anticuerpos monoclonales supera las limitaciones tanto de la tecnología de hibridoma como de las colecciones de anticuerpos expresados bacterialmente permitiendo que se aíslen los anticuerpos de alta afinidad generados durante respuestas inmunitarias in vivo de cualquier especie (Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 7843-7848) . SLAM permite que se identifique un único linfocito que está produciendo un anticuerpo con una especificidad o función deseada dentro de una población grande de células linfoides y que se rescate la información genética que codifica la especificidad del anticuerpo de ese linfocito. Las células productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que se unen a antígenos seleccionados se detectan usando un procedimiento de ensayo de placas hemolíticas adaptadas (Jerne y Nordin, 1963, Science, 140, 405) . En este ensayo, se recubren los eritrocitos con el antígeno seleccionado y se incuban con la población de células productoras de anticuerpos y una fuente de complemento. Se identifican las células productoras de anticuerpos individuales por la formación de placas hemolíticas. Se identifican las placas de eritrocitos lisados usando un microscopio invertido y se retiran las células productoras de anticuerpos individuales de interés en el centro de la placa usando técnicas de micromanipulación y se clonan los genes de anticuerpos de la célula por PCR de transcripción inversa. Otros procedimientos para detectar células productoras de anticuerpos individuales de una función deseada ya se han descrito en la especificación de patente internacional WO 92/02551.

El documento EP0286405 describe un procedimiento de fase homogénea de selección de células que produce un anticuerpo antiidiotípico que comprende poner en contacto una población de células productoras de anticuerpos con un anticuerpo marcado fluorescentemente producido por inmunización de un huésped con un antígeno de un patógeno seleccionado y seleccionar las células productoras de anticuerpos que se unen al antisuero marcado.

En el ensayo de placas hemolíticas descrito anteriormente, los glóbulos rojos se recubren normalmente con antígeno por medio de un sistema de acoplamiento de biotina/estreptavidina que requiere que se biotinile el antígeno. Por lo tanto, este procedimiento está restringido a los antígenos que están disponibles en una forma pura y a los que se pueden biotinilar sin afectar a la presentación de epítopos. Este procedimiento evita claramente el aislamiento de anticuerpos frente a un amplio rango de antígenos. Por ejemplo, muchas proteínas son difíciles de purificar, en particular las proteínas expresadas en la superficie celular, tales como las proteínas de tipo III. Muchas proteínas alteran su conformación y presentación de epítopos deseables después de la biotinilación, por ejemplo, las proteínas que contienen grupos lisina en su sitio activo.

También puede ser deseable producir anticuerpos frente a antígenos desconocidos, tales como las proteínas expresadas sobre la superficie de células, tales como células de tumor. El uso directo de células de tumor en el ensayo de placas en lugar de eritrocitos recubiertos con antígeno es difícil de lograr dado el requisito de que se produzca lisis celular para que se identifiquen las placas que contienen células productoras de anticuerpos. La lisis celular es dependiente del tipo de célula, la concentración de antígeno y de anticuerpo. Los glóbulos rojos recubiertos con el antígeno deseado se unirán a cantidades grandes de anticuerpos disponibles y se lisarán fácilmente en presencia de complemento. Otros tipos de células tales como células de tumor no se lisarán tan fácilmente, especialmente cuando la disponibilidad de antígeno sobre la superficie puede ser muy baja y por tanto, la unión a anticuerpo será baja.

Manz et al. (PNAS, 92, 1921-1925) dan a conocer un procedimiento para la identificación de células que segregan anticuerpos en las que el producto segregado se retiene sobre la superficie celular de las células analizadas. Las etapas requeridas incluyen la marcación de la superficie de la célula productora de anticuerpos con anticuerpos o antígenos de captura, la elevación artificialmente de la viscosidad del medio para detener la difusión y la alimentación cruzada del producto segregado entre células, etapas de lavado, identificación de células por procedimientos de clasificación de células activadas fluorescentes.

La presente invención trata estas dificultades por la materia objeto definida en las reivindicaciones adjuntas. Este ensayo mejorado tiene muchas ventajas sobre los procedimientos descritos anteriormente, permitiendo la identificación de anticuerpos que se unen a cualquier antígeno, incluyendo antígenos desconocidos, antígenos de superficie celular y antígenos que no se pueden biotinilar sin alterar la presentación de epítopos deseables. Como resultado, ahora se pueden producir anticuerpos con especificidades de unión que se identificaron previamente por ensayos de placas convencionales. Además, el ensayo es más simple que el ensayo de placas hemolíticas y las células productoras de anticuerpos se pueden identificar más rápidamente.

Los autores de la presente invención han demostrado que es posible obtener células productoras de anticuerpos que producen anticuerpos que se unen a un antígeno incubando una población de células productoras de anticuerpos con una fuente de antígeno en presencia de anticuerpos marcados que se unen a los anticuerpos producidos por las células productoras de anticuerpos. Sorprendentemente, es posible distinguir las células que producen anticuerpos que se unen a un antígeno de las que no lo hacen sin la necesidad de etapas de lavado para retirar el marcador no unido.

Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un ensayo homogéneo in vitro para identificar una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado que comprende:

a) proporcionar una población de células productoras de anticuerpos;

b) incubar sobre un portaobjetos de microscopio dicha población de células productoras de anticuerpos con un antígeno seleccionado conjugado con una perla o acoplado a un eritrocito, o antígeno expresado sobre la superficie de un célula, y un anticuerpo anti-anticuerpo marcado, en el que dicho anticuerpo anti-anticuerpo puede distinguir células que producen un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado de las células que no lo hacen y en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado se marca con un conjugado fluorescente; y c) sin necesidad de retirar anticuerpos anti-anticuerpo marcados no unidos, identificar una célula productora de anticuerpos capaz de producir un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado detectando el incremento en la concentración de anticuerpos anti-anticuerpo marcados que rodean la célula usando un microscopio.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye cualquier molécula de inmunoglobulina recombinante o que se produce de forma natural como un miembro de la clase de IgG, por ejemplo, IgG1, y también cualquier fragmento de inmunoglobulina de unión a antígeno, tal como fragmentos Fv, Fab' y F (ab') 2, y cualquier derivado del mismo, tal como fragmentos Fv monocatenarios.

El término "célula productora de anticuerpos", como se usa en el presente documento, significa cualquier célula que puede segregar un anticuerpo, tal como un linfocito B, una célula plasmática, un plasmablasto, un linfocito B activado o un linfocito B de memoria. Se pueden obtener células productoras de anticuerpos para el uso en la invención a partir de un animal que se ha inmunizado con un antígeno o bien que ha desarrollado una respuesta inmunitaria para un antígeno como resultado de una enfermedad. Otras células productoras de anticuerpos para el uso en la presente invención pueden incluir cualquier célula transformada, en particular, cualquier célula de mamífero que exprese genes de inmunoglobulina o partes de los mismos. En un ejemplo, las poblaciones de células productoras de anticuerpos para el uso en la presente invención producen un rango de anticuerpos con diferentes especificidades de unión.

1. Un ensayo homogéneo in vitro para identificar una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado que comprende:

a) proporcionar una población de células productoras de anticuerpos;

b) incubar sobre un portaobjetos de microscopio dicha población de células productoras de anticuerpos con un antígeno seleccionado conjugado con una perla o acoplado a un eritrocito, o antígeno expresado sobre la superficie de un célula, y un anticuerpo anti-anticuerpo marcado, en el que dicho anticuerpo anti-anticuerpo puede distinguir células que producen un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado de las células que no lo hacen y en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado se marca con un conjugado fluorescente; y c) sin necesidad de retirar anticuerpos anti-anticuerpo marcados no unidos, identificar una célula productora de anticuerpos capaz de producir un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado detectando el incremento en la concentración de anticuerpos anti-anticuerpo marcados que rodean la célula usando un microscopio.

2. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el antígeno se acopla a un eritrocito.

3. El ensayo de la reivindicación 1, en el que el antígeno se acopla a una perla.

4. El ensayo de la reivindicación 3, en el que el antígeno se acopla a una perla por medio de un anticuerpo policlonal.

5. El ensayo de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo policlonal es un fragmento de anticuerpo.

6. El ensayo de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo policlonal es un fragmento Fab, Fab' o F (ab') 2 de anticuerpo.

7. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la célula que expresa el antígeno es una célula transfectada.

8. El ensayo de la reivindicación 1, en el que la célula que expresa el antígeno es una célula de tumor.

9. El ensayo de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el antígeno es un agente contagioso.

10. El ensayo de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado es un anticuerpo anti-Fc.

11. El ensayo de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado fluorescente se marca con FITC.

12. El ensayo de la reivindicación 11, en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado con FITC es un anticuerpo anti-Fc.

13. El ensayo de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las células productoras de anticuerpos son linfocitos B, células de plasma, plasmablastos, linfocitos B activados o linfocitos B de memoria.

14. El ensayo de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la célula productora de anticuerpos es una célula de hibridoma o una célula de mamífero modificada para expresar anticuerpos.

15. Un procedimiento in vitro para producir un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado que comprende: a) proporcionar una población de células productoras de anticuerpos; b) incubar sobre un portaobjetos de microscopio dicha población de células productoras de anticuerpos con un

antígeno seleccionado conjugado con una perla o acoplado a un eritrocito, o antígeno expresado sobre la superficie de un célula, y un anticuerpo anti-anticuerpo marcado, en el que dicho anticuerpo anti-anticuerpo puede distinguir células que producen un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado de las células que no lo hacen y en el que el anticuerpo anti-anticuerpo marcado se marca con un conjugado fluorescente;

c) sin necesidad de etapas de lavado, identificar una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une al antígeno seleccionado detectando el incremento en la concentración de anticuerpos antianticuerpo marcados que rodean la célula usando un microscopio;

d) aislar la célula productora de anticuerpos identificada; y e) sintetizar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la misma.

Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5