Un método para el diagnóstico de artritis reumatoide, comprendiendo dicho método;

(i) determinar la cantidad de MIC-1 presente en una muestra corporal de un individuo de prueba, y

(ii)comparar dicha cantidad determinada contra la cantidad, o rango de cantidades, presente en una(s) muestra(s) corporal(es) equivalente(s) de individuo(s) normales; en donde niveles elevados de MIC-1 están asociados con artritis reumatoide

Ensayo para diagnóstico que involucra a la citoquina-1 (MIC-1) inhibidora de macrófagos.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con el campo del diagnóstico médico. En particular, la invención proporciona métodos para el diagnóstico de artritis reumatoide.

Antecedentes de la invención

La superfamilia del factor de crecimiento de transformación ß (TGF-ß) consiste de un número creciente de moléculas que regulan una variedad de procesos celulares tales como el crecimiento, diferenciación y oncogénesis. Los miembros de la superfamilia del TGF-ß han sido clasificados en grupos de familias principales que incluyen TGF-ß, proteína morfogénica ósea (BMP), factor de crecimiento y diferenciación (GDF), inhibina/activina, sustancia inhibidora de Müller (MIS), factor neurotrófico derivado de células gliales (GDNF) y, más recientemente, citoquina 1 inhibidora de macrófagos (Bootcov y colaboradores, 1997). La participación de la superfamilia del TGF-ß en el embarazo en humanos es indicada por la detección de TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3, activina e inhibina en fluido amniótico y la localización de TGF-ß1, activina e inhibina en las vellosidades coriales (Graham y colaboradores, 1992; Petraglia y colaboradores, 1993a; Petraglia y colaboradores, 1992; Minami y colaboradores, 1992; Lang y Searle, 1994; Qu y Thomas, 1992; Altman y colaboradores, 1990; Canniggia y colaboradores, 1999; Wallace y colaboradores, 1997).

La superfamilia del TGF-ß ha sido estudiada intensivamente debido a su importancia biológica y potencial terapéutico. Su biología y funciones son bien conocidas y han sido extensamente revisadas (por ejemplo, Miyazono y colaboradores, 1993; Wahl, 1992; y Roberts y colaboradores, 1993). Son factores quimiotácticos potentes para macrófagos y fibroblastos y generalmente inhibe la proliferación celular, quizás debido a su papel en la diferenciación. En el contexto de la inflamación, TGF-ß es un potente estimulador de fibroblastos, colágeno y síntesis de proteínas de la matriz, promueve angiogénesis, modula la expresión de moléculas de adhesión e inhibe la proliferación de linfocitos, la producción de algunas linfoquinas y la función de células NK. Las proteínas del TGF-ß también han estado muy implicadas en la patogénesis de procesos y mecanismos inflamatorios crónicos.

La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmune asociada con procesos inflamatorios crónicos. Los métodos de diagnóstico y detección de trastornos autoinmunes se apoyan típicamente en la aparición de los síntomas que caracterizan el trastorno. Más recientemente, se han llevado a cabo estudios para diagnosticar artritis reumatoide midiendo los niveles de ciertos factores en muestras de pacientes. Por ejemplo, WO 99/21011 divulga que se expresan en una enfermedad autoinmune tal como artritis reumatoide, colágenos tipos IX y XI, así como colágeno tipo II. La detección y medición de los cambios en la distribución y los niveles de colágeno de tipo IX en una muestra de un paciente tal como suero o fluido sinovial, así como colágeno de tipo II en algunas modalidades, puede proporcionar una evaluación diagnóstica de los estados patológicos de trastornos autoinmunes (tales como artritis reumatoide) y trastornos del tejido conectivo y asociados con colágeno Tipo IX.

Los presentes solicitantes han clonado y caracterizado recientemente un miembro divergente de la superfamilia del TGF-ß, la citoquina 1 inhibidora de macrófagos (MIC-1) (Bootcov y colaboradores, 1997), cuya expresión está asociada con activación de macrófagos. Los presentes solicitantes han desarrollado también un ensayo por inmunoabsorción tipo sándwich ligado a enzimas (ELISA) para la cuantificación de MIC-1 y utilizado éste para investigar la relación entre concentraciones de MIC-1 en suero humano y una enfermedad inflamatoria, tal como artritis reuma- toide.

Además, los presentes solicitantes han encontrado que existen una cantidad de variantes alélicas de MIC-1, todas las cuales muestran diferencias menores en la secuencia de aminoácidos en las posiciones 9, 48 y 202 (ver la publicación internacional de patente No. WO 97/00958 en donde MIC-1 es denominada como CL13). Los más significativo de estas posiciones es la posición del aminoácido 202 ya que este corresponde a la posición 6 de la forma madura de MIC-1 (es decir, habiendo sido removida la secuencia líder a través de escisión). En algunas de las variantes identificadas, el residuo normal de histidina (H) en la posición 202 (o "H6") está sustituido con ácido aspártico (D). Esto es debido a una sustitución de un solo nucleótido dentro del gen para MIC-1 de tal manera que una citosina (C) en la posición 604 está sustituida por una guanosina (G). Los presentes solicitantes han reconocido ahora que individuos que son ya sea heterocigotos u homocigotos para la variante alélica Asp²⁰² -MIC-1 (o "D6") pueden tener una predisposición alterada y un curso de la enfermedad para enfermedad(es) inflamatoria(s) y/o cancerosa(s).

Revelación de la invención

Los presentes solicitantes han encontrado que niveles elevados de MIC-1 en ciertas muestras corporales pueden estar asociados con artritis reumatoide (ver la Figura 8D). Por ejemplo, el examen de las biopsias de individuos después de tratamiento con una dosis alta de corticosteroide administrado por vía intravenosa, mostró una marcada disminución en la expresión de MIC-1 en células inmunes (ver la Figura 1).

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico de artritis reumatoide, comprendiendo dicho método:

(i) determinar la cantidad presente de MIC-1 en una muestra corporal de un individuo de prueba, y

(ii) comparar dicha cantidad determinada contra la cantidad, o rango de cantidades, presentes en muestra(s) corporal(es) equivalente(s) de individuo(s) normal(es) en donde niveles elevados de MIC-1 están asociados con artritis reumatoide.

La muestra corporal utilizada en el método del primer aspecto puede ser una muestra de orina, fluido cerebroespinal, fluido seminal o biopsia de tejido. Sin embargo, preferiblemente, la muestra corporal es una muestra de suero sanguíneo o plasma, o fluido sinovial.

Se puede determinar fácilmente la cantidad presente de MIC-1 en una muestra corporal por medio de inmunoensayos o inmunohistoquímica (por ejemplo con secciones de biopsias de tejido) utilizando anticuerpos (monoclonales o policlonales) o fragmentos de los mismos contra MIC-1. Se pueden producir anticuerpos anti-MIC-1 y fragmentos de los mismos por medio de cualquiera de los métodos conocidos en el arte.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico o evaluación de artritis reumatoide en un individuo humano, comprendiendo dicho método la determinación de la presencia de una proteína variante de MIC-1 que tiene ácido aspártico en la posición 202 o una posición correspondiente a la posición 202 de MIC-1 humana inmadura de tipo silvestre en una muestra adecuada de dicho individuo.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para evaluar una predisposición a la artritis reumatoide en un individuo humano, comprendiendo dicho método la determinación de la presencia de una proteína variante de una MIC-1 que tiene ácido aspártico en la posición 202 o en una posición correspondiente a la posición 202 de MIC-1 humana inmadura de tipo silvestre en una muestra adecuada de dicho individuo.

La detección de una proteína variante de MIC-1 que tiene ácido aspártico en la posición 202 o una posición correspondiente a la posición 202 de MIC-1 humana inmadura de tipo silvestre es indicativa de artritis reumatoide o una predisposición a artritis reumatoide.

Se puede determinar fácilmente la presencia de la proteína variante de MIC-1 por medio de un inmunoensayo utilizando anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de discriminar entre MIC-1 humana normal o de "tipo silvestre" o variantes que tienen histidina en la posición 202 y variantes de MIC-1 que tienen ácido aspártico en la posición 202. Tales anticuerpos, o fragmentos de los mismos, pueden incrementarse con MIC-1 o Asp²⁰²-MIC-1 utilizando cualquiera de los métodos comúnmente conocidos en el arte. Alternativamente, se pueden incrementar los anticuerpos adecuados para discriminación, o fragmentos de los mismos, utilizando péptidos inmunogénicos, opcionalmente conjugados con una proteína portadora tal como albúmina de suero bovino, que incluye un epítopo que abarca la...

1. Un método para el diagnóstico de artritis reumatoide, comprendiendo dicho método;

2. Un método de acuerdo a la reivindicación 1, en donde la cantidad de MIC-1 presente en la muestra corporal se determina por medio de un inmunoensayo o inmunohistoquímica utilizando anticuerpos o fragmentos de los mismos contra MIC-1.

3. Métodos para diagnosticar o valorar la artritis reumatoide en un individuo humano, comprendiendo dicho método la determinación de la presencia de una proteína variante de MIC-1 que tiene ácido aspártico en la posición 202 o una posición correspondiente a la posición 202 de MIC-1 de tipo silvestre humana inmadura en una muestra adecuada de dicho individuo.

4. Un método para valorar una predisposición a la artritis reumatoide en un individuo humano, comprendiendo dicho método la determinación de la presencia de una proteína variante de MIC-1 que tiene ácido aspártico en la posición 202 o una posición correspondiente a la posición 202 de MIC-1 de tipo silvestre humana inmadura en una muestra adecuada de dicho individuo.

5. Un método de acuerdo a la reivindicación 3 ó 4, en donde la presencia de una variante de una proteína Mix-1 en dicha muestra se determina por medio de un inmunoensayo.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha muestra se selecciona entre sangre entera, suero sanguíneo, plasma, orina o biopsia de tejido.