METODO DE ENRIQUECIMIENTO DE CELULAS FETALES.

Un método para enriquecer células fetales en una muestra de sangre materna en el que las células que son CD34+ y son capaces de adherirse a un soporte sólido se seleccionan,

y dicho método comprende, en cualquier orden:

a) el enriquecimiento de la muestra en células CD34+; y

b) la puesta en contacto de la muestra con un soporte sólido y recogida de las células que se adhieren a dicho soporte sólido separando las células capaces de resistir un lavado vigoroso sin liberarse del soporte, en el que dicho soporte sólido posee o consiste en una superficie de vidrio o plástico

Método de enriquecimiento de células fetales.

La presente invención está relacionada con un método para enriquecer células fetales en una muestra de sangre materna y con un método para obtener una muestra analizable de células fetales. La muestra obtenida mediante los mé-todos de la presente invención es particularmente útil para el diagnóstico fetal no invasivo y la determinación del sexo.

Existe una gran demanda de diagnóstico fetal no invasivo y de determinación del sexo. Alrededor del 0,7% de todos los niños nacidos vivos tienen una anomalía congénita asociada con un defecto cromosómico y el diagnóstico prenatal de tales defectos es por lo tanto de gran interés. Ejemplos de desórdenes cromosómicos que pueden detectarse (si están presentes) en las células fetales incluyen los siguientes síndromes (Edwards, Patau, Downs, DiGeorge, Wolf-Hirschom, Cri du chat) y varios estados causados por microdeleciones.

Los procedimientos actuales de diagnóstico prenatal fetal incluyen la amniocentesis y la toma de muestras de vellosidades coriónicas. La amniocentesis implica la inserción de una aguja a través del abdomen de la embarazada hasta el útero y la extracción de líquido amniótico del saco que rodea el feto. La toma de muestras de las vellosidades coriónicas (CVS) se realiza insertando un catéter o aguja en la placenta y extrayendo una pequeña muestra de tejido. Estos procedimientos son invasivos y en consecuencia causan molestias a la madre e implican un riesgo, particularmente para el feto. El riesgo de aborto oscila entre alrededor del 0,5% y el 1% pero puede llegar hasta el 2%. Algunos estudios indican que la CVS puede causar defectos en los dedos de pies y manos del niño. La amniocentesis se realiza durante o tras la semana 15 de embarazo y la CVS entre la semana 10 y la 12 para minimizar el riesgo para el feto. Sería preferible poseer un método que pudiera realizarse en una fase anterior del embarazo. El coste de estos procedimientos también es considerable. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar métodos alternativos no invasivos. El análisis de células fetales a partir de sangre periférica materna representa un método no invasivo.

Toda una serie de células fetales (por ejemplo, eritroblastos, linfocitos) entran en el torrente sanguíneo materno durante el embarazo en pequeñas cantidades y la presencia de células fetales en la sangre periférica materna se ha determinado mediante muchos estudios. Sin embargo, la proporción de células fetales en sangre periférica materna normal es normalmente muy baja, y oscila de 1:10⁵ a 1:10⁹. Esta proporción es demasiado baja para permitir un análisis directo de las células fetales.

Puede realizarse un análisis indirecto utilizando técnicas de DNA como la amplificación del DNA fetal mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, puede utilizarse la PCR para analizar la presencia en una muestra de sangre materna de un gen de herencia exclusivamente paterna como el gen sry (que se localiza en el cromosoma Y) o, si la madre es rhesus negativa, el gen rhesus. Sin embargo, como esta aproximación es indirecta no es adecuada para todos los tipos de aplicaciones deseadas, por ejemplo no puede utilizarse para el diagnóstico de anomalías cromosómicas fetales como las aneuploidías en células individuales de origen fetal.

Por el contrario, los métodos directos permiten la detección de una anomalía genética así como la determinación del sexo en células individuales.

El análisis directo de células fetales requiere de un enriquecimiento de las células fetales en la muestra de sangre materna para obtener una muestra analizable. Se han puesto a prueba toda una serie de métodos anteriormente.

Muchos grupos han intentado expandir células fetales como progenitores eritroides fetales o progenitores hemapoyéticos fetales a través de cultivo (por ejemplo, Chen et al., 1998, Manotaya et al., 2002 y Campagnoli et al. 2002). Sin embargo, los métodos de cultivo poseen una baja probabilidad de éxito, especialmente en la detección de células fetales en sangre materna antes de la semana 16 de gestación. Además, los métodos de cultivo son costosos en tiempo ya que son necesarias unas 2-4 semanas de incubación antes de que las células fetales puedan analizarse. También existe la pequeña posibilidad de que el genotipo de las células fetales pueda sufrir cambios a medida que las células pasan por ciclos repetitivos de división celular durante el paso de cultivo.

Otros métodos implican la utilización de anticuerpos que se unen a las células fetales. Los anticuerpos pueden inmovilizarse (Mueller et al., 1990, "Isolation of fetal tropoblasts cells from peripheral blood of pregnant women" The Lancet 336: 197-200) o marcarse con porciones de unión que permiten la separación de células marcadas de las no marcadas (por ejemplo Herzenberg et al., 1979 "Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescence-activated cell sorting", Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 76:1453-1455 y Little et al. - 1997, Blood, vol 89, Nº 7, págs. 2347-2358).

La WO 2005/123779 proporciona anticuerpos que se unen preferentemente a las células fetales en lugar de a las células maternas y describe los métodos para utilizar tales anticuerpos para el aislamiento de células fetales.

Los antígenos de los grupos de diferenciación (CD) son un grupo de marcadores que normalmente se utilizan como diana de anticuerpos monoclonales específicos para aislar células que son portadoras de un antígeno CD concreto (por ejemplo, Bianchi et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 93: 705-708). Este método implica la incubación de las células con un anticuerpo monoclonal adecuado marcado, por ejemplo con un colorante fluorescente o una cuenta paramagnética, seguida de la separación de las células unidas al anticuerpo de las no unidas utilizando la tecnología de separación celular activada por fluorescencia o separación celular activada magnéticamente, respectivamente. Los resultados obtenidos en estos estudios no fueron satisfactorios, ya que no daban lugar a una proporción de células fetales suficiente para un análisis fiable. Esto ocurre porque hasta la fecha, no se ha identificado ningún marcador celular adecuado que sea exclusivo de las células fetales y que pueda ser reconocido mediante anticuerpos. Los anticuerpos que se han probado hasta la fecha, incluyendo los anticuerpos frente a los antígenos CD, reconocen tanto las células fetales como las maternas.

Las proporciones entre células maternas y células fetales obtenidas con estos anticuerpos no son satisfactorias, con muestras que contienen proporciones tan bajas de células fetales que no son adecuadas para un análisis fiable.

Por lo tanto existe la necesidad de un método para obtener una muestra que contenga una concentración analizable de células fetales. Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que mediante el aislamiento de la población de células CD34+ de la sangre materna y seleccionando aquellas células capaces de adherirse a un soporte sólido, puede obtenerse una proporción significativa y clínicamente útil de células fetales. El soporte sólido preferiblemente debe ser transparente y poseer buenas propiedades ópticas para la inspección microscópica. El soporte sólido posee o consiste en una superficie de vidrio o plástico. Preferiblemente, el soporte sólido es plástico adecuado para cultivo tisular. Los recipientes de plástico adecuado para cultivo tisular apropiados son los que fabrica Corning Incorporated, New York, USA. El soporte sólido puede estar recubierto con una sustancia adecuada, como proteínas, por ejemplo colágeno o fibronectina, glucosaminoglucanos, por ejemplo heparán sulfato o ácido hialurónico o carbohidratos complejos, sólo los recubrimientos que no estimulan de forma significativa la unión de las células no fetales se contemplan en la presente invención.

Las células fetales que están enriquecidas de acuerdo con este método son preferiblemente mononucleares, pequeñas (diámetro aproximado de 10 micras) con una morfología similar a la de un linfocito y con una proporción núcleo:citoplasma elevada.

Por lo tanto en un aspecto, se proporciona un método para enriquecer células fetales en una muestra de sangre materna en el que las células que son CD34+ y capaces de adherirse a un soporte sólido se seleccionan, y dicho método comprende, en cualquier orden:

1. Un método para enriquecer células fetales en una muestra de sangre materna en el que las células que son CD34+ y son capaces de adherirse a un soporte sólido se seleccionan, y dicho método comprende, en cualquier orden:

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paso (b) se realiza sobre el producto del paso (a).

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el paso (a) se realiza sobre el producto del paso (b).

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que se utiliza un ligando con afinidad por CD34.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 en el que dicho ligando con afinidad es un anticuerpo.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 en el que un marcador seleccionable que puede unirse a dicho ligando con afinidad se pone en contacto con la muestra previamente, de forma simultanea, o tras poner en contacto la muestra con dicho ligando con afinidad.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho marcador seleccionable consiste en una cuenta magnética o un colorante fluorescente.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 4 a 7 en el que dicho ligando con afinidad está conjugado con un marcador como las cuentas magnéticas, biotina o los fluorocromos.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en el que la selección de células adherentes comprende poner en contacto la muestra con un soporte sólido e incubar durante entre 1 y 18 horas a un rango de temperatura de 20-38ºC.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en el que el método se realiza sobre la fracción mononuclear de la muestra de sangre materna.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dichas células seleccionadas se someten a un análisis genético.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicho análisis genético incluye la determinación del sexo.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que dicho análisis genético incluye el cribado de una anomalía genéticas fetal.