Un método para diagnosticar o controlar lupus sistémico eritematoso (SLE),

que comprende: (a) determinar, en una muestra sanguínea del individuo, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B en la muestra, y (b) comparar dichas determinaciones con, respectivamente, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T o linfocito B de control, donde un aumento en el nivel de componente C4d del complemento indica que el individuo tiene lupus sistémico eritematoso (SLE)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a métodos para diagnosticar enfermedades o afecciones inflamatorias determinando los niveles de componentes de la vía del complemento sobre la superficie de glóbulos blancos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al diagnóstico y/o el control de pacientes con afecciones y enfermedades inflamatorias inmunológicas, por ejemplo, lupus sistémico eritematoso (SLE). La inflamación es una característica de casi todas las enfermedades o afecciones del sistema inmune y todas las enfermedades o afecciones infecciosas. Muchas afecciones y enfermedades inflamatorias crónicas, es decir, enfermedades o afecciones del sistema inmune y enfermedades o afecciones infecciosas, causan daño a múltiples sistemas orgánicos y son difíciles de diagnosticar. Como los síntomas de muchas

15 afecciones y enfermedades inflamatorias inmunológicas solapan existe una gran necesidad de métodos de diagnóstico para diagnosticar y controlar de forma rápida y fiable enfermedades y afecciones del sistema inmune específicas. La presente invención resuelve esta y otras necesidades. La presente invención proporciona un método para diagnosticar o controlar el lupus sistémico eritematoso (SLE) que comprende:

(a) determinar, en una muestra sanguínea del individuo el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B en la muestra, y (b) comparar dichas determinaciones con, respectivamente, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T o linfocito B de control, donde un aumento en el nivel del componente C4d del complemento indica que el individuo tiene lupus sistémico eritematoso (SLE).

30 El diagnóstico de SLE también puede conseguirse determinando el nivel de C4d sobre un linfocito T o un linfocito B en combinación con al menos otro componente más de la vía del complemento. En una realización, se determinan los niveles de los componentes C4d y C3d del complemento para diagnosticar o controlar el SLE. Los niveles de C4d pueden determinarse como anteriormente. Los niveles de C3d pueden determinarse usando, por ejemplo, anticuerpos específicos para C3d. Los anticuerpos pueden marcarse para la detección y por ejemplo, pueden usarse anticuerpos policlonales o monoclonales.

En otra realización, el linfocito T o linfocito B se aísla usando un anticuerpo específico para el linfocito, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3, CD4, CD8 o CD19.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un programa informático que, cuando se ejecuta en un ordenador, realiza un método de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho programa informático:

(a) un código para recibir datos que corresponden a una determinación de un componente C4d del complemento depositado sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B;

(b) un código para recuperar un valor de referencia para el nivel del componente C4d del complemento depositado sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B de los individuos;

(c) un código para comparar los datos en (a) con el valor de referencia en (b).

También se proporciona un medio legible en ordenador para almacenar un programa informático de acuerdo con el anterior.

Marquart et al., Clin. Exp. Immunol. 101, 60-65 (1995) describe la deposición aumentada de C3dg sobre linfocitos B en SLE.

Manzi et al., Lupus 13, 298-303 (2004) describe ensayos para detectar C4d sobre eritrocitos para el diagnóstico y control de la actividad de enfermedad en SLE.

Katyal et al., Current Science 81(8), 907-914 (2001) describe que el receptor 1 del complemento se expresa en monocitos y linfocitos B y T, entre otros tipos celulares.

van den Elsen et al., J. Mol. Biol. 332, 1103-1115 (2002) muestra la estructura cristalina por rayos X del fragmento C4d de C4 humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 demuestra que el componente C4d de la vía del complemento se deposita específicamente sobre linfocitos T de sangre periférica de pacientes con SLE. La deposición de C4d sobre linfocitos T de sangre periférica se determinó por un ensayo de citometría de flujo de 2 colores. Los linfocitos T se identificaron usando un anticuerpo monoclonal conjugado con FITC específico para CD3 (un marcador superficial para linfocitos T), y el C4d depositado sobre estas células se determinó usando un anticuerpo monoclonal anti-C4d seguido de un anticuerpo secundario conjugado con PE. Los datos mostrados son la fluorescencia media específica de C4d (SMF) de linfocitos T de sangre periférica obtenida de pacientes con SLE (n=87, diamantes), pacientes con otras enfermedades autoinmunes (n=31, cuadrados), o controles sanos (n=19, triángulos). Se determinó empíricamente un punto de corte de fluorescencia media específica para distinguir individuos con linfocitos T C4d-positivos (SMF > 58) de aquellos con linfocitos T C4dnegativos (SMF < 58). Las frecuencias de individuos con linfocitos T C4dpositivos entre los grupos se compararon usando el ensayo Chi-cuadrado, y los valores p para cada par comparado se muestran por encima de la línea horizontal. El valor medio de la fluorescencia específica de C4d sobre los linfocitos T entre los grupos se comparó usando el ensayo T de Student y los valores p respectivos se muestran por debajo de la línea horizontal.

La Figura 2 demuestra que el componente C3d de la vía del complemento se deposita específicamente sobre linfocitos T de sangre periférica de pacientes con SLE. La deposición de C3d sobre linfocitos T de sangre periférica se determinó por un ensayo de citometría de flujo de 2 colores. Los linfocitos T se identificaron usando un anticuerpo monoclonal conjugado con FITC específico para CD3 (un marcador superficial para linfocitos T), y el C3d depositado sobre estas células se determinó usando un anticuerpo monoclonal anti-C4d seguido de un anticuerpo secundario conjugado con PE. Los damos mostrados son la fluorescencia media específica de C3d de linfocitos T de sangre periférica obtenida de pacientes con SLE (n=87, diamantes), pacientes con otras enfermedades autoinmunes (n=31, cuadrados), o controles sanos (n=19, triángulos). Se determinó empíricamente un punto de corte de fluorescencia media específica para distinguir individuos con linfocitos T C3d-positivos (SMFC > 3) de aquellos con linfocitos T C3dnegativos (SMFC < 3). Las frecuencias de individuos con linfocitos T C4dpositivos entre los grupos se compararon usando el ensayo Chi-cuadrado, y los valores p para cada par comparado se muestran por encima de la línea horizontal. El valor medio de fluorescencia específica de C3d sobre linfocitos T entre los grupos se comparó usando el ensayo T de Student y los valores p respectivos se muestran por debajo de la línea horizontal.

La Figura 3 demuestra que los ligandos C4d y C3d del complemento se depositan específicamente sobre linfocitos T de sangre periférica de pacientes con SLE. La deposición de C3d y C4d sobre linfocitos T de sangre periférica se determinó por un ensayo de citometría de flujo de 2 colores. Los linfocitos T se identificaron usando un anticuerpo monoclonal conjugado con FITC específico para CD3 (un marcador superficial para linfocitos T), y el C3d/C4d depositado sobre estas células se determinó usando un anticuerpo monoclonal anti-C3d (o anti-C4d), seguido de un anticuerpo secundario conjugado con PE. Los datos mostrados son fluorescencia media específica de C3d y C4d de linfocitos T de sangre periférica obtenida de pacientes con SLE (n=87), pacientes con otras enfermedades autoinmunes (n=31), o controles sanos (n=19). Se determinaron empíricamente los puntos de corte de fluorescencia media específica para distinguir individuos con linfocitos T C3d-positivos (SMFC > 3) o individuos con linfocitos T C4d-positivos (SMFI > 58) de aquellos con linfocitos T C3dnegativos o C4d-negativos. El valor medio de fluorescencia específica de C3d sobre linfocitos T entre los grupos se comparó usando el ensayo T de Student y los valores p respectivos p son <0,0001 (no mostrados).

La Figura 4 proporciona niveles de C4d sobre la superficie de linfocitos T, linfocitos B, y monocitos. Se determinó C4d sobre diferentes tipos celulares por un ensayo de citometría de flujo de 3 colores usando anticuerpos monoclonales específicos para marcadores superficiales específicos de células y C4d o inmunoglobulinas de control de isotipo. Los niveles de C4d se calcularon como la...

1. Un método para diagnosticar o controlar lupus sistémico eritematoso (SLE), que comprende:

(a) determinar, en una muestra sanguínea del individuo, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T

o un linfocito B en la muestra, y

(b) comparar dichas determinaciones con, respectivamente, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T

o linfocito B de control, donde un aumento en el nivel de componente C4d del complemento indica que el individuo tiene lupus sistémico eritematoso (SLE).

2. El método de la reivindicación 1, en el que los glóbulos blancos se aíslan usando un anticuerpo anti-CD3.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el nivel del componente C4d del complemento se determina usando un anticuerpo específico para el componente C4d del complemento.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo contra C4d está marcado.

5. El método de la reivindicación 3, en el que el anticuerpo contra C4d es un anticuerpo monoclonal.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se determina el nivel de al menos otro componente del complemento.

7. El método de la reivindicación 6, en el que se determina el nivel del componente C3d del complemento.

8. El método de la reivindicación 7, en el que se determina el nivel del componente C3d del complemento usando un anticuerpo específico para el componente C3d del complemento.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo contra C3d está marcado.

10. El método de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo contra C3d es un anticuerpo monoclonal.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende:

(a) determinar, en una muestra sanguínea del individuo, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T en la muestra, y

(b) comparar dichas determinaciones con, respectivamente, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito T de control, donde un aumento en el nivel del componente C4d del complemento indica que el individuo tiene lupus sistémico eritematoso (SLE).

12. El método de la reivindicación 1, que comprende:

(a) determinar, en una muestra sanguínea del individuo, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito B en la muestra, y

(b) comparar dichas determinaciones con, respectivamente, el nivel del componente C4d de la vía del complemento sobre la superficie de un linfocito B de control, donde un aumento en el nivel del componente C4d del complemento indica que el individuo tiene lupus sistémico eritematoso (SLE).

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha determinación y comparación se realiza por un programa informático, comprendiendo dicho programa informático:

(a) un código para recibir datos que corresponden a una determinación de un componente C4d del complemento depositado sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B;

(b) un código para recuperar un valor de referencia para el nivel del componente C4d del complemento depositado sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B de individuos;

(c) un código para comparar los datos en (a) con el valor de referencia en (b).

14. Un programa informático que, cuando se ejecuta por un ordenador, realiza un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho programa informático: (a) un código para recibir datos que corresponden a una determinación de un componente C4d del complemento depositado sobre la superficie de un linfocito T o un linfocito B;

(b) un código para recuperar un valor de referencia para el nivel del

componente C4d del complemento depositado sobre la superficie de un 10 linfocito T o un linfocito B de individuos;

(c) un código para comparar los datos en (a) con el valor de referencia en (b).

15. Un medio legible en ordenador que almacena un programa informático 15 de acuerdo con la reivindicación 14.