SISTEMA PARA LA SELECCION ESPECIFICA DE LAS CELULAS Y ESPECIFICA DEL DESARROLLO DE CELULAS MADRE EMBRIONARIAS DIFERENCIANTES, CELULAS MADRE ADULTAS Y CELULAS DE LA LINEA GERMINAL EMBRIONARIAS.

Método para obtener células cardiacas o células madre, excepto células madre embrionarias humanas,

que se diferencian en células cardiacas, comprendiendo dicho método: (a) introducir en células madre, excepto células madre embrionarias humanas, por lo menos un vector que contiene secuencias de ADN que contienen la información para por lo menos un gen informador que codifica una proteína fluorescente que no daña la células y por lo menos un gen de resistencia que es responsable de la resistencia a puromicina, donde ambas secuencias de ADN se encuentran bajo el control del mismo promotor que se selecciona entre un promotor específico de células cardiacas y está unido operativamente a dichos genes, donde dichas células se transfectan de manera estable; y (b) detectar la expresión de dicho gen informador; (c) añadir un agente selectivo para la selección de aquellas células que expresan el gen informador y el gen de resistencia; (d) obtener las células diferenciadas o diferenciantes que se desarrollan a partir de dichas células madre bajo el control del promotor específico de células cardiacas

La presente invención se refiere a un método para obtener células cardiacas o células madre, excepto células madre embrionarias humanas y células de la línea germinal embrionaria humana, que se diferencian en células cardiacas. [0002] La cardiomiogénesis de células madre embrionarias (ES) diferenciantes en cultivo se sugirió como una fuente ilimitada de células del músculo cardiaco para el transplante en sustitución de la terapia de tejido cardiaco dañado irreversiblemente (Klug et al., 1996). Uno de los obstáculos principales para la implementación práctica de esta estrategia es el rendimiento relativamente bajo de células del músculo cardiaco derivadas de ES diferenciadas, que constituyen normalmente no más de un 1-3% de la población global de células de ES diferenciantes. [0003] Además, las aún existentes células donantes ES no diferenciadas plantean una potencial amenaza para el receptor en las etapas posteriores de la diferenciación con respecto al desarrollo de tumores. Por lo tanto, el objetivo de desarrollar un método de selección eficaz y altamente específico es considerado como un hito en la terapia celular de los trastornos cardiacos. [0004] Ya se ha demostrado anteriormente que se puede seleccionar de manera satisfactoria una población enriquecida en células del músculo cardiaco a partir de células ES modificadas genéticamente que se transfectan de manera estable con un transgén de un gen con resistencia a fármacos de aminoglicósido-fosfato-transferasa (α-MHC-Neo) controlado por un promotor α de la cadena pesada de la miosina del corazón (Klug et al., 1996). Este trabajo también mostró los potenciales problemas para el desarrollo de esta estrategia en un procedimiento eficaz a gran escala:

a) Se llevó a cabo el tratamiento con un fármaco selectivo (G418) en un cultivo adherente de células ES diferenciantes, mientras que desde el punto de vista de la efectividad, así como la viabilidad tecnológica, la estrategia óptima sería la aplicación del fármaco selectivo directamente sobre la suspensión de agregados de cuerpos embrioides (cuerpos embrioides = EB) -células ES (Wobus et al., 1991).

b) Los experimentos posteriores con respecto a la introducción de células seleccionadas genéticamente en el corazón de animales receptores se convierten en significativamente más complicados por el trabajo para demostrar el destino de las introducciones en ausencia de marcadores de viabilidad específicos para células donantes. [0005] El documento DE –A-19727962 describe células madre embrionarias de mamíferos no humanos que se transfectan de manera estable con una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína fluorescente que no daña a la célula, donde dicha secuencia de ADN se encuentra bajo el control de un promotor dependiente de la célula y/o del desarrollo (Kolosov et al., 1998). Dichas células ES recombinantes muestran las siguientes desventajas:

1. Aunque se puede disponer de tipos de células específicas in vitro con este método, no obstante, es difícil la purificación de estas células teñidas de manera vital. Por un lado, esto se puede explicar por el hecho de que las células de interés (por ejemplo, cardiomiocitos) representan sólo aproximadamente el 1-3% de las células generadas en EB. Por otro lado, los métodos de purificación de células (por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia, FACS) son perfectamente adecuados para células inmunológicas. En la purificación, sin embargo, de, por ejemplo, los cardiomiocitos, muchas células perecen o son dañadas irreversiblemente.

2. Además, resultó que con el método de purificación con higromicina en EB emplacados, las células no resistentes a higromicina son difíciles de extraer incluso después de 7-14 días de la selección. A pesar de la utilización de higromicina como marcador de selección de antemano, apareció una generación de tumores. Esto se aplica de manera similar a una selección con neomicina. [0006] Un objetivo de la presente invención es proporcionar un sistema nuevo para tanto la selección como la extracción de células, respectivamente, a partir de un cultivo diferenciador de células madre embrionarias, células de la línea germinal embrionarias y células madre adultas que evitan los problemas mencionados anteriormente. Como “sistema” se entiende una combinación de métodos de selección, células y utilización de las células y métodos particularmente en el campo médico, tal como se describe en la presente solicitud. Este objetivo se consigue mediante el método de la reivindicación

1. Las realizaciones preferidas de la presente invención se describen en las reivindicaciones después de la reivindicación 1. [0007] Se describe un sistema para la selección específica de célula cardiaca y/o desarrollo de células madre embrionarias diferenciantes, células de la línea germinal embrionaria y células madre adultas mediante la aplicación combinada de resistencia (a fármacos) y genes informadores detectables bajo el control común de un promotor específico de células cardiacas y/o desarrollo. Las células madre embrionarias humanas y las células de la línea germinal embrionaria humana, así como su uso en el método de la invención se excluyen explícitamente del alcance. [0008] La presente invención se ilustra en primer lugar en general y posteriormente mediante ejemplos basados en la selección genética de células cardiacas de un cultivo diferenciante de células madre embrionarias que se transfectan con dos tipos de vectores. Se enfatiza que la invención no se limita a estas realizaciones particulares, sino que es aplicable a los 3 tipos de células derivadas de la capa germinal, es decir, endodermo, mesodermo y ectodermo y células derivadas de las mismas debido a la pluripotencia de las células madre y las células de la línea germinal, respectivamente. Un experto en la materia es capaz de variar la invención en el alcance de las reivindicaciones adjuntas teniendo en cuenta la siguiente descripción y su conocimiento general. [0009] Según la presente invención, la información para por lo menos un gen de resistencia y para por lo menos un gen informador detectable que codifica una proteína fluorescente que no daña las células, se introduce en las células madre embrionarias, las células de la línea germinal embrionaria y células madre adultas. La información para ambos genes puede estar disponible en uno o distribuido sobre dos vectores. Lo importante es que la expresión del gen para la proteína detectable, por ejemplo, fluorescente, así como para el gen de resistencia se encuentre bajo control de uno y el mismo promotor. [0010] Según la presente invención, los promotores se seleccionan entre promotores específicos de células y promotores específicos del desarrollo. Los promotores específicos de células y tejidos, respectivamente, se refieren a aquellos que son activos en poblaciones de células específicas y tejidos específicos, respectivamente. Según la presente invención, los promotores que se utilizan son activos en células del músculo cardiaco (cardiomiocitos). [0011] Algunos ejemplos de promotores específicos del corazón son: Nkx-2.5 (específico para cardiomiocitos muy tempranos y células precursoras mesodérmicas, respectivamente, (Lints et al., 1993); α-actina cardiaca humana (específica para el tejido cardiaco, (Sartorelli et al., 1990), MLC-2V (específico para células del músculo cardiaco ventricular (O'Brien et al., 1993) y WO-A-96/16163). [0012] Algunos ejemplos de promotores no específicos del corazón son: PECAM1, FLK-1 (endotelio), nestina (células precursoras neuronales), promotor 1 de tirosina hidroxilasa (neuronas dopaminérgicas), α-actina de músculo liso, miosina de músculo liso (músculos lisos), α1-fetoproteína (endodermo), cadena pesada de músculo liso (promotor mínimo de SMHC (específico para músculos lisos, (Kallmeier et al., 1995). [0013] El término promotor específico del desarrollo se refiere a promotores que son activos durante ciertos puntos de tiempo durante el desarrollo. Algunos ejemplos de dichos promotores son el promotor β-MHC que se expresa durante el desarrollo embrionario en el ventrículo del ratón y es suplantado por el promotor α-MHC en la fase prenatal. NKx2.5, un promotor durante el desarrollo temprano del mesodermo/corazón, factor natriurético atrial, un marcador del corazón embrionario prematuro, con la excepción del estimulador que se subregula también en etapas del desarrollo posterior, Flk-1, un promotor específico de endotelio que es activo durante la vasculogénesis inicial, segmento de intrón 2 del gen de nestina que se expresa en células precursoras neuronales...

1. Método para obtener células cardiacas o células madre, excepto células madre embrionarias humanas, que se diferencian en células cardiacas, comprendiendo dicho método:

(a) introducir en células madre, excepto células madre embrionarias humanas, por lo menos un vector que contiene secuencias de ADN que contienen la información para por lo menos un gen informador que codifica una proteína fluorescente que no daña la células y por lo menos un gen de resistencia que es responsable de la resistencia a puromicina, donde ambas secuencias de ADN se encuentran bajo el control del mismo promotor que se selecciona entre un promotor específico de células cardiacas y está unido operativamente a dichos genes, donde dichas células se transfectan de manera estable; y

(b) detectar la expresión de dicho gen informador;

(c) añadir un agente selectivo para la selección de aquellas células que expresan el gen informador y el gen de resistencia;

(d) obtener las células diferenciadas o diferenciantes que se desarrollan a partir de dichas células madre bajo el control del promotor específico de células cardiacas.

2. Método según la reivindicación 1, donde dichas células son células de mamífero.

3. Método según la reivindicación 2, donde las células de mamífero derivan de primates o roedores, particularmente de ratones, ratas o conejos o son de origen humano.

4. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde dicha proteína fluorescente que no daña las células se selecciona entre Proteína Verde Fluorescente (potenciada) (EGFP y GFP), Proteína Roja Fluorescente (RFP), Proteína Azul Fluorescente (BFP), Proteína Amarilla Fluorescente (YFP), y Proteína Cian Fluorescente (CFP), en particular GFP.

5. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde el promotor específico de células cardiacas se selecciona entre los promotores Nkx2.5, α actina humana, α MHC, β MHC, ANF, Braquiuria y MLC-2V.

6. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde el promotor está unido a secuencias de ADN funcionales adicionales, en particular secuencias potenciadoras o secuencias represoras o secuencias IRES.

7. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde el promotor específico de células cardiacas está unido operativamente a un gen de

resistencia a puromicina.

8. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde

a) las células contienen de manera estable dos vectores, donde el primer vector contiene secuencias de ADN que codifican por lo menos un gen informador y el segundo vector contiene secuencias de ADN que codifican por lo menos un gen de resistencia, donde ambas secuencias de ADN se encuentran bajo el control del mismo promotor; o

b) las células contienen un vector que contiene secuencias de ADN que codifican por lo menos un gen informador y por lo menos un gen de resistencia, ambos localizados en uno y el mismo vector y estando bajo el control de uno y el mismo promotor, donde preferiblemente una secuencia IRES se localiza preferiblemente entre el gen informador y el gen de resistencia; o

c) la célula contiene dos grupos de sistemas de vectores selectivos, que comprenden:

- un primer vector que tiene secuencias de ADN que codifican un primer gen informador y un primer gen de resistencia, ambos estando bajo el control de un primer promotor específico de las células y/o del desarrollo que está unido operativamente a dichas secuencias;

- un segundo vector que tiene secuencias de ADN que codifican un segundo gen informador y un segundo gen de resistencia, ambos estando bajo el control de un segundo promotor específico de las células y/o del desarrollo que está unido operativamente a dichas secuencias.

9. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células contienen un gen de resistencia adicional para la selección de aquellas células que se transfectan de manera estable con las construcciones de vectores, cuyo gen de resistencia es diferente del primer y segundo gen de resistencia.

10. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células se cultivan como agregados celulares, en particular en forma de cuerpos embrioides.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el vector o vectores se introducen mediante transfección, electroporación, vectores virales

o lipofección.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la selección de aquellas células que contienen el vector comprende, antes de la etapa (a), añadir un primer agente selectivo para seleccionar células transfectadas de manera estable.

13. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células madre pluripotentes se cultivan en forma de cuerpos embrioides o en un cocultivo con otras células.

14. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde dichas células se cultivan en suspensión y/o como “cuerpos embrioides”.

15. Método según una o más de las reivindicaciones anteriores, donde se utiliza puromicina como agente selectivo para seleccionar aquellas células que expresan el gen informador y/o donde las células seleccionadas se someten a clasificación celular para un enriquecimiento adicional.

16. Cultivo celular, excepto un cultivo celular de células madre embrionarias humanas, que muestra una expresión específica de las células y/o del desarrollo de un gen informador y un gen de resistencia, donde dichas células contienen la construcción o construcciones de vectores tal como se definen en una o más de las reivindicaciones anteriores.

17. Células cardiacas o células madre que se diferencian en células cardiacas, excepto células madre embrionarias humanas, que contienen la construcción

o construcciones de vectores tal como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

18. Método para el análisis toxicológico de sustancias, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: -proporcionar un cultivo celular según la reivindicación 16 o células según la reivindicación 17; -introducir sustancias, cuyos efectos tóxicos o no tóxicos deben analizarse en dicho cultivo celular;

- analizar cuantitativa y/o cualitativamente la fluorescencia de las células obtenidas de este modo y comparar dichas células con las células que se cultivaron sin la sustancia a analizar.