MODELOS DE SELECCIÓN IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y OTROS TRASTORNOS RELACIONADOS CON QPCT.

Animal transgénico no humano que sobreexpresa glutaminil ciclasa que comprende células que contienen un transgén de ADN que codifica para glutaminil ciclasa.

Modelos de selección in vivo para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos relacionados con QPCT La presente invención se refiere en general a animales transgénicos así como a métodos y composiciones para seleccionar, especialmente en relación con glutaminil ciclasa. En particular, la invención se refiere a Qpct (es decir, glutaminil péptido ciclotransferasa), también denominada glutaminil ciclasa (QC, EC 2.3.2.5) que cataliza la ciclación intramolecular de residuos de glutamina N-terminales para dar ácido piroglutámico (5-oxo-prolina, pGlu*) con liberación de amoniaco y la ciclación intramolecular de residuos de glutamato N-terminales para dar ácido piroglutámico con liberación de agua. Messer aisló por primera vez una QC del látex de la planta tropical Carica papaya en 1963 (Messer, M. 1963 Nature 4874, 1299). 24 años más tarde, se descubrió una actividad enzimática correspondiente en la hipófisis animal (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. y Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632). Para la QC de mamífero, podía mostrarse la conversión de Gln en pGlu mediante la QC para los precursores de TRH y GnRH (Busby, W. H. J. et al. 1987 J Biol Chem 262, 8532-8536; Fischer, W. H. y Spiess, J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84, 3628-3632). Además, experimentos de ubicación iniciales de QC revelaron una localización conjunta con sus supuestos productos de catálisis en hipófisis bovina, mejorando además la función sugerida en la síntesis de hormonas peptídicas (Bockers, T. M. et al. 1995 J Neuroendocrinol 7, 445-453). En cambio, la función fisiológica de la QC vegetal es menos clara. En el caso de la enzima de C. papaya, se sugirió un papel en la defensa de la planta frente a microorganismos patógenos (El Moussaoui, A. et al. 2001 Cell Mol Life Sci 58, 556-570). Recientemente, se identificaron supuestas QC de otras plantas mediante comparaciones de secuencias (Dahl, S. W. et al.2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). La función fisiológica de estas enzimas, sin embargo, es todavía ambigua. Las QC conocidas de plantas y animales muestran una especificidad estricta para L-glutamina en la posición Nterminal de los sustratos y se encontró que su comportamiento cinético obedecía a la ecuación de Michaelis-Menten (Pohl, T. et al. 1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88, 10059-10063; Consalvo, A. P. et al. 1988 Anal Biochem 175, 131- 138; Gololobov, M. Y. et al. 1996 Biol Chem Hoppe Seyler 377, 395-398). Una comparación de las estructuras primarias de las QC de C. papaya y la de la QC de mamífero altamente conservada, sin embargo, no reveló ninguna homología de secuencia (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36). Mientras que las QC vegetales parecen pertenecer a una nueva familia de enzimas (Dahl, S. W. et al. 2000 Protein Expr Purif 20, 27-36), se encontró que las QC de mamífero tenían una homología de secuencia pronunciada con aminopeptidasas bacterianas (Bateman, R. C. et al. 2001 Biochemistry 40, 11246-11250), lo que condujo a la conclusión de que las QC de plantas y animales tienen diferentes orígenes evolutivos. El documento EP 02 011 349.4 da a conocer polinucleótidos que codifican para glutaminil ciclasa de insecto, así como polipéptidos codificados por los mismos. Esta solicitud proporciona además células huésped que comprenden vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos de la invención. Los polipéptidos aislados y las células huésped que comprenden QC de insecto son útiles en métodos de selección de agentes que reducen la actividad glutaminil ciclasa. Tales agentes se describen como útiles como pesticidas. La materia de la presente invención es particularmente útil en el campo de enfermedades relacionadas con glutaminil ciclasa, siendo un ejemplo de las mismas la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por la acumulación anómala de placas amiloidóticas extracelulares estrechamente asociadas con neuronas distróficas, astrocitos reactivos y microglía (Terry, R. D. y Katzman, R. 1983 Ann Neurol 14, 497-506; Glenner, G. G. y Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Intagaki, S. et al. 1989 J Neuroimmunol 24, 173-182; Funato, H. et al. 1998 Am J Pathol 152, 983-992; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741-766). Los péptidos beta amiloides(abreviado como A) son los componentes primarios de las placas seniles y se considera que están directamente implicados en la patogénesis y progresión de la EA, una hipótesis apoyada por estudios genéticos (Glenner, G. G. y Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120, 885-890; Borchelt, D. R. et al. 1996 Neuron 17, 1005-1013; Lemere, C. A. et al. 1996 Nat Med 2, 1146-1150; Mann, D. M. y Iwatsubo, T. 1996 Neurodegeneration 5, 115-120; Citron, M. et al. 1997 Nat Med 3, 67-72; Selkoe, D. J. 2001 Physiol Rev 81, 741- 766). Se genera A mediante procesamiento proteolítico de la proteína precursora de -amiloide (APP) (Kang, J. et al. 1987 Nature 325, 733-736; Selkoe, D. J. 1998 Trends Cell Biol 8, 447-453), que se escinde secuencialmente por -secretasa en el extremo N-terminal y por -secretasa en el extremo C-terminal de A (Haass, C. y Selkoe, D. J. 1993 Cell 75, 1039-1042; Simons, M. et al. 1996 J Neurosci 16 899-908). Además de los péptidos de A dominantes que comienzan con L-Asp en el extremo N-terminal (A1-42/40), aparece una gran heterogeneidad de formas truncadas en el extremo N-terminal en las placas seniles. Se notifica que tales péptidos acortados son más neurotóxicos in vitro y se agregan más rápidamente que las isoformas de longitud completa (Pike, C. J. et al. 1995 J Biol Chem 270, 23895-23898). Se sabe que se sobreproducen péptidos N-truncados en sujetos con EA familiar de aparición temprana (EAF) (Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C, et al. 2000 Nature 405, 531-532), que aparecen de manera temprana y aumentan con la edad en cerebros con síndrome de Down (SD) (Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416, Russo, C. et al. 2001 Neurobiol Dis 8, 173-180; Tekirian, T. L. et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94). Finalmente, su cantidad refleja la gravedad progresiva de la enfermedad (Russo, 2 E08707977 18-11-2011   C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Guntert, A. et al. 2006 Neuroscience 143, 461-475). Procesos postraduccionales adicionales pueden modificar adicionalmente el extremo N-terminal mediante isomerización o racemización del aspartato en la posición 1 y 7 y mediante ciclación de glutamato en los residuos 3 y 11. Las isoformas que contienen piroglutamato en la posición 3 [pGlu 3 A3-40/42] representan las formas prominentes, aproximadamente el 50% de la cantidad de A total, de las especies N-truncadas en placas seniles (Mori, H. et al. 1992 J Biol Chem 267, 17082-17086, Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Russo, C. et al. 1997 FEBS Lett 409, 411-416; Tekirian, T. L. et al. 1998 J Neuropathol Exp Neurol 57, 76-94; Geddes, J. W. et al. 1999 Neurobiol Aging 20, 75-79; Harigaya, Y. et al. 2000 Biochem Biophys Res Commun 276, 422-427) y también están presentes en lesiones preamiloides (Lalowski, M. et al. 1996 J Biol Chem 271, 33623-33631). La acumulación de péptidos AN3 (pE) se debe probablemente a la modificación estructural que potencia la agregación y confiere resistencia frente a la mayoría de aminopeptidasas (Saido, T. C. et al. 1995 Neuron 14, 457-466; Tekirian, T. L. et al. 1999 J Neurochem 73, 1584-1589). Estas pruebas proporcionan claves de un papel fundamental de los péptidos AN3 (pE) en la patogénesis de la EA. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre sus propiedades de agregación y neurotoxicidad (He, W. y Barrow, C. J. 1999 Biochemistry 38, 10871-10877; Tekirian, T. L. et al. 1999 J Neurochem 73, 1584-1589). Además, la acción de estas isoformas sobre células gliales y la respuesta glial a estos péptidos se desconocen completamente, aunque la glía activada está asociada estrictamente con placas seniles y podría contribuir activamente a la acumulación de depósitos amiloides. En estudios recientes, se investigaron la toxicidad, propiedades de agregación y catabolismo de los péptidos A1-42, A1-40, [pGlu 3 ]A3-42, [pGlu 3 ]A3-40, [pGlu 11 ]A11-42 y [pGlu 11 ]A11-40 en cultivos de células gliales y neuronales, y se mostró que la modificación con piroglutamato exacerba las propiedades tóxicas de péptidos de A y también inhibe su degradación por astrocitos cultivados. Shirotani et al. investigaron la generación de péptidos [pGlu 3 ]A en neuronas corticales primarias infectadas con virus Sindbis in vitro. Construyeron ADN complementarios de proteína precursora de amiloide, que codificaban para un posible precursor de [pGlu 3 ]A mediante deleción y sustitución de aminoácidos. Para un precursor artificial que comienza con un residuo de glutamina N-terminal en lugar de glutamato en el precursor... [Seguir leyendo]

1. Animal transgénico no humano que sobreexpresa glutaminil ciclasa que comprende células que contienen un transgén de ADN que codifica para glutaminil ciclasa. 2. Animal transgénico no humano según la reivindicación 1, siendo el animal heterocigoto para el transgén. 3. Animal transgénico no humano según la reivindicación 1, siendo el animal homocigoto para el transgén. 4. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, siendo el animal un ratón. 5. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el transgén es de origen murino. 6. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el transgén es de origen humano. 7. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el transgén es un gen recombinante. 8. Animal transgénico no humano según la reivindicación 7, en el que el transgén recombinante codifica para un polipéptido quimérico o humanizado. 9. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el transgén codifica para una isoenzima de glutaminil ciclasa. 10. Animal transgénico no humano según la reivindicación 9, en el que la isoenzima es una proteína seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de SEQ ID NOS: 15-25. 11. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el transgén codifica para un fragmento de la secuencia de aminoácidos de glutaminil ciclasa o una secuencia de glutaminil ciclasa modificada, en el que dicho fragmento o secuencia modificada conserva la función del polipéptido de glutaminil ciclasa de longitud completa. 12. Animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el transgén está operativamente unido a un promotor específico de tejido. 13. Método de selección de agentes biológicamente activos que inhiben o promueven la producción de glutaminil ciclasa in vivo, que comprende: determinar el efecto de un agente de prueba ya administrado sobre la cantidad de glutaminil ciclasa producida en el animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 14. Célula o línea celular que contiene un transgén de ADN que codifica para glutaminil ciclasa y que sobreexpresa glutaminil ciclasa, que se deriva del animal transgénico no humano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 15. Ratón transgénico que sobreexpresa glutaminil ciclasa, que comprende una secuencia de nucleótidos transgénica que codifica para glutaminil ciclasa operativamente unida a un promotor, integrada en el genoma del ratón, demostrando el ratón un fenotipo que puede revertirse o mejorarse con un inhibidor de glutaminil ciclasa. 16. Ratón según la reivindicación 15, siendo el ratón heterocigoto para glutaminil ciclasa. 17. Ratón según la reivindicación 15, siendo el ratón homocigoto para glutaminil ciclasa. 18. Ratón según la reivindicación 15, en el que la secuencia transgénica codifica para glutaminil ciclasa murina. 19. Ratón según la reivindicación 15, en el que la secuencia transgénica codifica para glutaminil ciclasa humana. 20. Ratón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que el transgén codifica para una isoenzima de glutaminil ciclasa. 21. Ratón según la reivindicación 20, en el que la isoenzima es una proteína seleccionada del grupo que consiste en una cualquiera de SEQ ID NOS: 15-25. 22. Ratón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, en el que el transgén codifica para un fragmento de la secuencia de aminoácidos de glutaminil ciclasa o una secuencia de glutaminil ciclasa modificada, en el que dicho fragmento o secuencia modificada conserva la función del polipéptido de glutaminil ciclasa de 73   longitud completa. 23. Método de selección de agentes terapéuticos que inhiben o promueven la actividad glutaminil ciclasa que comprende (a) evaluar los efectos de agentes de prueba ya administrados sobre el fenotipo neurológico del ratón según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 22, y (b) seleccionar un agente de prueba que inhibe o promueve la actividad glutaminil ciclasa. 74     76   77   - ADN WT + ADN WT 78   79     Generación F0 WT WT WT WT 81   WT WT 82   83   84 WT WT WT   Plasma WT Plasma WT QC de plasma QC de plasma QC de hígado QC de cerebro Hígado Cerebro   86 zx   Cerebro WT Cerebro con QC 87 Hígado WT Hígado con QC Riñón WT Riñón con QC   88   89     91   92   93   94