CÉLULAS ES MODIFICADAS Y GEN ESPECÍFICO DE CÉLULAS ES.

Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleica seleccionada de entre el grupo de secuencias siguientes:

a) SEC ID nº 1, o el fragmento nucleotídico 1409-2878 de SEC ID nº 1; b) el fragmento nucleotídico 3111-3670 de SEC ID nº 1; c) una secuencia nucleica que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, después de la alineación óptima con una secuencia definida en a) o en b) que desempeña una función en el carácter de pluripotencia de las células ES y que se puede utilizar como marcador del carácter de pluripotencia de las células ES; d) la secuencia complementaria o la secuencia de ARN procedente de la secuencia tal como la definida en a), b) o c)

La presente invención se refiere a unas células ES de pájaro modificadas, que expresan específicamente un gen exógeno cuando poseen un carácter pluripotente. La invención se refiere asimismo a un ácido nucleico y a un polipéptido expresados específicamente en las células de pájaro pluripotentes, así como a unos métodos de detección del carácter pluripotente de células que utilizan este ácido nucleico y este polipéptido.

Las células ES son unas células pluripotentes aisladas de embrión muy precoz, que son capaces de participar en la morfogénesis de todos los tejidos incluyendo el tejido germinal, después de su transplante en unos embriones hospedantes. Estas células han sido en primer lugar aisladas en el ratón en el que se utilizan muy ampliamente para la creación de animales mutantes que llevan unas modificaciones muy determinadas de su genoma. Unas células ES han sido aisladas y caracterizadas en los pájaros (Pain et al., 1996). Estas células pueden ser utilizadas para modificar el patrimonio genético del pollo (Etches et al., Pain et al., 1999). Un medio de cultivo que permite mantener el carácter pluripotente de estas células de pájaros ha constituido el objeto de la solicitud de patente WO 96/12793.

La dificultad encontrada por todos los que desean aislar unas células ES en cultivo se refiere a la identificación rápida de estas células y de su carácter pluripotente. Se han utilizado varios marcadores celulares tales como la expresión de una actividad fosfatasa alcalina (Strickland et al., 1980), la expresión de epítopos antigénicos (Kemler et al., 1981, Solter y Knowles 1978), la expresión de proteínas específicas tales como OCT-3 (Rosner et al., 1990), la expresión de una actividad telomerasa (Prowse y Greider 1995). Las proteínas OCT-3, REX-1, UTF-1 entre otras han sido identificadas hasta ahora sólo en el ratón. La verificación última del carácter pluripotente se basa en el análisis de las potencialidades morfogenéticas de estas células después de su injerto en unos embriones hospedantes, lo cual representa un ensayo muy pesado.

Otra dificultad encontrada con el cultivo de las células ES en cultivo comprende la obtención de poblaciones celulares de un grado de heterogeneidad baja y satisfactoria, y el problema del control del crecimiento en cultivo de células no-pluripotentes. En efecto, un problema particular está asociado a la presencia continua de ciertos tipos celulares diferenciados, es decir que estas células son capaces de eliminar las células ES del cultivo induciendo su diferenciación o su muerte celular programada.

La presente invención propone simplificar la identificación del carácter pluripotente de células de pájaros en cultivo, mediante la divulgación de una secuencia nucleica (gen ens-1) expresada específicamente y selectivamente por las células pluripotentes.

Así, la presente invención tiene por objeto un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia nucleica seleccionada de entre el grupo de secuencias siguientes:

a) SEC ID nº 1, o el fragmento nucleotídico 1409-2878 de SEC ID nº 1;

b) el fragmento nucleotídico 3111-3670 de SEC ID nº 1;

c) una secuencia nucleica que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, después de la alineación óptima con una secuencia definida en a) o en b), que desempeña una función en el carácter de pluripotencia de las células ES y que se puede utilizar como marcador del carácter de pluripotencia de las células ES;

d) la secuencia complementaria o la secuencia de ARN procedente de la secuencia tal como se define en a), b) o c).

Preferentemente, la base presente en 2773 de SEC ID nº 1 es una "t", codificando el codón correspondiente entonces para una treonina.

La secuencia de ácidos nucleicos según la invención definida en c) presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 80% después de la alineación óptima con una secuencia tal como se define en a) o en b) anteriormente, preferentemente 90%, de manera más preferida 98%. Preferentemente, la secuencia definida en c) o en d) se compara con una de las secuencias definidas en a).

Por ácido nucleico, secuencia nucleica o de ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, secuencia de polinucleótido, secuencia nucleotídica, términos que se utilizarán indiferentemente en la presente descripción, se entiende designar una cadena precisa de nucleótidos, modificados o no, que permiten definir un fragmento o una región de un ácido nucleico, que comprende o no unos nucleótidos no naturales, y que puede corresponder tanto a un ADN bicatenario, un ADN monocatenario como a unos productos de transcripción de dichos ADN. Así, las secuencias nucleicas según la invención engloban asimismo los PNA (Peptid Nucleic Acid), o análogos.

Se debe entender que la presente invención no se refiere a las secuencias nucleotídicas en su entorno cromosómico natural, es decir en el estado natural. Se trata de secuencias que han sido aisladas y/o purificadas, es decir que han sido extraídas directa o indirectamente, por ejemplo mediante copia, habiendo sido su entorno parcialmente modificado. Se entiende así designar asimismo los ácidos nucleicos obtenidos por síntesis química.

Mediante la expresión "porcentaje de identidad" entre dos secuencias nucleicas o de aminoácidos en el sentido de la presente invención, se entiende designar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y siendo las diferencias entre las dos secuencias repartidas al azar y sobre toda su longitud. Se entiende designar por "mejor alineación" o "alineación óptima" la alineación para la cual el porcentaje de identidad determinado como anteriormente es el más elevado. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se realizan tradicionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, siendo dicha comparación realizada por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación se puede realizar, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970), por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988), por medio de programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Con el fin de obtener la alineación óptima, se utiliza preferentemente el programa BLAST, con la matriz BLOSUM 62. Se pueden utilizar asimismo las matrices PAM o PAM250.

**(Ver fórmula)**

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se determina comparando estas dos secuencias alineadas de manera óptima, pudiendo comprender la secuencia de ácidos nucleicos

o de aminoácidos a comparar unas adiciones o unas deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el residuo de aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Por secuencias nucleicas que presentan un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, preferentemente 90%, de manera más preferida 98%, después de la alineación óptima con una secuencia de referencia, se entiende designar las secuencias nucleicas que presentan, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones tales como, en particular, una deleción, un truncamiento, un alargamiento, una fusión quimérica y/o una sustitución, en particular puntual, y cuya secuencia nucleica presenta por lo menos 80, preferentemente 90%, de manera más preferida 98%, de identidad después de la alineación óptima con la secuencia nucleica de referencia. Se trata preferentemente de secuencias cuyas secuencias complementarias son susceptibles de hibridarse específicamente con la secuencia... [Seguir leyendo]

1. Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleica seleccionada de entre el grupo de secuencias siguientes:

a) SEC ID nº 1, o el fragmento nucleotídico 1409-2878 de SEC ID nº 1;

b) el fragmento nucleotídico 3111-3670 de SEC ID nº 1;

c) una secuencia nucleica que presenta un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, después de la alineación óptima con una secuencia definida en a) o en b) que desempeña una función en el carácter de pluripotencia de las células ES y que se puede utilizar como marcador del carácter de pluripotencia de las células ES;

d) la secuencia complementaria o la secuencia de ARN procedente de la secuencia tal como la definida en a), b) o c).

2. Ácido nucleico purificado o aislado según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende o está constituido por la SEC ID nº 1, la secuencia complementaria o la secuencia de ARN procedente de una de estas secuencias.

3. Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado porque codifica para un polipéptido que posee un fragmento continuo de por lo menos 200 aminoácidos de la proteína SEC ID nº 2.

4. Polipéptido aislado, caracterizado porque comprende un polipéptido seleccionado de entre:

a) un polipéptido de secuencia SEC ID nº 2,

b) un polipéptido que comprende por lo menos 80% de identidad con dicho polipéptido de a), que desempeña una función en el carácter de pluripotencia de las células ES y que se puede utilizar como marcador del carácter de pluripotencia de las células ES.

5. Polipéptido según la reivindicación 4, caracterizado porque está constituido por una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº 2, o una secuencia que posee por lo menos 80% de identidad con esta secuencia después de la alineación óptima.

6. Vector de clonación y/o de expresión que comprende un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, o que codifica para un polipéptido según una de las reivindicaciones 4 y 5.

7. Célula hospedante, con la excepción de las células ES humanas, caracterizada porque se transforma mediante un vector según la reivindicación 6.

8. Célula hospedante, que contiene un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se trata de una célula ES de pájaro modificada además mediante la introducción de un gen exógeno, estando dicho gen exógeno integrado en dicho ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, y siendo único y específicamente expresado cuando dicha célula se mantiene en el estado pluripotente.

9. Célula según la reivindicación 8, caracterizada porque dicho gen exógeno es un gen informador.

10. Célula según la reivindicación 9, caracterizada porque dicho gen informador se selecciona de entre lacZ, GFP, luciferasa, ROSA-β-geo, y un gen de resistencia a un antibiótico.

11. Célula hospedante que contiene un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque se trata de una célula de pájaro modificada además mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno, estando dicho ácido nucleico exógeno integrado en dicho ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Célula según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho ácido nucleico exógeno es un gen de interés terapéutico, eventualmente precedido de un promotor espacio-temporal y/o de secuencias de terminación.

13. Célula según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho ácido nucleico exógeno es un marcador genético.

14. Célula según una de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizada porque dicho pájaro pertenece al orden de las galliformes.

15. Célula según la reivindicación 14, caracterizada porque dicho pájaro es un pollo o una codorniz.

16. Célula según una de las reivindicaciones 14 y 15, caracterizada porque dicho gen informador está integrado bajo el control del promotor del gen ens-1 de secuencia nucleotídica 3111-3670 de SEC ID nº 1.

17. Célula según una de las reivindicaciones 14 y 15, caracterizada porque se trata de una célula 9N2.5, depositada en la Collection Nationale des Microorganismes el 11 de mayo de 2000 con el número de orden 1-2477.

18. Célula de pájaro diferenciada, caracterizada porque se deriva de una célula ES según una de las reivindicaciones 8 a 17.

19. Animal, salvo el ser humano, caracterizado porque comprende una célula según una de las reivindicaciones 7 a 18.

20. Utilización de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre una secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 1, y una secuencia nucleica que se hibrida en unas condiciones de fuerte astringencia con una de estas secuencias, como sonda o cebador, para la detección y/o la amplificación de secuencias de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3.

21. Utilización de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 1, y una secuencia nucleica que se hibrida en unas condiciones de fuerte astringencia con una de estas secuencias, como oligonucleótido sentido o antisentido específico de una secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3.

22. Utilización de una secuencia de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, para la producción de un polipéptido recombinante según la reivindicación 4 ó 5.

23. Procedimiento de obtención de un polipéptido recombinante, caracterizado porque se cultiva una célula según la reivindicación 7 en unas condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y porque se recupera dicho polipéptido recombinante, siendo dicho polipéptido el polipéptido según la reivindicación 4 ó 5.

24. Polipéptido recombinante, caracterizado porque se obtiene mediante un procedimiento según la reivindicación 23.

25. Anticuerpo monoclonal o policlonal, caracterizado porque une selectivamente un polipéptido según una de las reivindicaciones 4, 5 ó 24.

26. Procedimiento de detección de un polipéptido según una de las reivindicaciones 4, 5 ó 24, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

**(Ver fórmula)**

a) poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo según la reivindicación 25;

b) demostrar el complejo antígeno-anticuerpo formado.

27. Kit de agentes reactivos para la realización de un procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque comprende:

a) un anticuerpo monoclonal o policlonal según la reivindicación 25;

b) eventualmente unos agentes reactivos para la constitución de un medio propicio para la reacción inmunológica;

c) los agentes reactivos que permiten la detección del complejo antígeno-anticuerpo producido durante la reacción inmunológica.

28. Procedimiento de determinación del carácter pluripotente de una célula ES de pájaro, caracterizado porque se determina la presencia de un producto de expresión del gen de secuencia SEC ID nº 1, o del ARNm de SEC ID nº 1.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado porque la detección del ARNm de SEC ID nº 1 se efectúa mediante transferencia Northern o mediante RT-PCR utilizando una sonda o unos cebadores, para una utilización según la reivindicación 20.

30. Procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado porque se detecta la presencia de la proteína SEC ID nº 2, utilizando por ejemplo un anticuerpo según la reivindicación 25.

31. Procedimiento de clasificación de la pertenencia de un pájaro al orden de las galliformes, caracterizado porque se detecta, en el genoma de dicho pájaro, la presencia de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 1 y una secuencia nucleica que se hibrida en unas condiciones de fuerte astringencia con una de estas secuencias.

32. Procedimiento de determinación de la presencia de una muestra que procede de un pájaro del orden de las galliformes en una muestra alimenticia, caracterizado porque se detecta, en dicha muestra, la presencia de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 1 y una secuencia nucleica que se hibrida en unas condiciones de fuerte astringencia con una de estas secuencias.

33. Chip de ADN, caracterizado porque contiene una secuencia nucleica según una de las reivindicaciones 1 a 3.

**(Ver fórmula)**

34. Chip de proteínas, caracterizado porque contiene un polipéptido según una de las reivindicaciones 4, 5 ó 24, o un anticuerpo según la reivindicación 25.

35. Procedimiento de detección y/o de dosificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, en una muestra biológica o alimenticia, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) poner en contacto dicha muestra con una secuencia de ácido nucleico marcada seleccionada de entre un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3, un fragmento de por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 1 y una secuencia nucleica que se hibrida en unas condiciones de fuerte astringencia con una de estas secuencias;

b) detectar y/o dosificar el híbrido formado entre dicho polinucleótido y el ácido nucleico de dicha muestra.

36. Procedimiento de detección y/o de dosificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada de entre un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3, en una muestra biológica o alimenticia, caracterizado porque comprende una etapa de amplificación de los ácidos nucleicos de dicha muestra con la ayuda de cebadores seleccionados de entre los ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones 1 a 2, los fragmentos de por lo menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEC ID nº 1 y las secuencias nucleicas que se hibridan en unas condiciones de fuerte astringencia con una de estas secuencias.

37. Procedimiento de cribado de una sustancia o de un medio capaces de inducir una diferenciación de las células pluripotentes, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) mantener células ES, con la excepción de las células ES humanas, según una de las reivindicaciones 7 a 17 en un medio de cultivo que permite el mantenimiento del fenotipo pluripotente;

b) añadir dicha sustancia en dicho medio de cultivo o sustituir dicho medio de cultivo por el medio a ensayar;

c) determinar la inducción de la diferenciación mediante la ausencia de expresión de la proteína SEC ID nº 2 o del gen exógeno.

38. Procedimiento según la reivindicación 37, caracterizado porque se efectúa con unas células según una de las reivindicaciones 8 a 17.

39. Procedimiento según la reivindicación 37 ó 38, caracterizado porque se utilizan unas células 9N2.5 y porque se detecta la ausencia de expresión de la β-galactosidasa.

40. Procedimiento de cribado de una sustancia capaz de restaurar el carácter pluripotente de células diferenciadas que se derivan de células según una de las reivindicaciones 8 a 17, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) mantener células diferenciadas que se derivan de células según una de las reivindicaciones 8 a 17 en un medio de cultivo adecuado;

b) sustituir dicho medio de cultivo por un medio que permite mantener un fenotipo pluripotente, y que contiene dicha sustancia a ensayar;

c) determinar la restauración del carácter pluripotente de dichas células mediante la expresión de la proteína SEC ID nº 2 o del gen exógeno, en dichas células.

41. Procedimiento según la reivindicación 40, caracterizado porque se utilizan unas células 9N2.5 diferenciadas, y porque se detecta la expresión de la β-galactosidasa.

42. Compuesto caracterizado porque se selecciona de entre: a) un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 3; b) un polipéptido según una de las reivindicaciones 4, 5 ó 24; c) un vector según la reivindicación 6; d) una célula según una de las reivindicaciones 7 a 17; e) un anticuerpo según la reivindicación 25,

a título de medicamento.

43. Utilización de la secuencia nucleotídica 3111-3670 de SEC ID nº 1 como promotor de un gen de interés para una expresión específica de dicho gen de interés en unas células pluripotentes aviares.