MEDIO DE CULTIVO DE CÉLULAS EMBRIONARIAS TOTIPOTENTES AVIARES.

Procedimiento de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares (o células ES aviares),

caracterizado porque: 1) Se suspenden unas células que proceden de discos blastodérmicos de huevos de pájaro fecundados en un medio de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares, del tipo que comprende un medio de cultivo para células aviares, que comprende: a) b-FGF, SCF y LIF, o b) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF, IL-11, IL-6, e IGF-1, o c) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF e IGF-1. (bFGF = basic Fibroblast Growth Factor; SCF = Stem Cell Factor; LIF = Leukemia lnhibitory Factor; IL11 = Interleukin 11; IL6 = Interleukin 6; IGF-1 = Insulin-like Growth Factor-1; aSCF = avian Stem Cell Factor) 2) Se inocula un tapiz de células nutricias con la suspensión obtenida al final de la etapa a), 3) Se ponen las células a incubar, 4) Las células en cultivo son extraídas y purificadas con el fin de recuperar unas células ES aviares

La presente invención se refiere a la obtención de células ES aviares, en particular a un procedimiento de cultivo y a un medio que permite el cultivo de estas células.

En efecto, en el ámbito de la puesta a punto de técnicas de producción de proteínas recombinantes, el desarrollo de una técnica de transgénesis en los pájaros domésticos tendrá unas repercusiones económicas extremadamente importantes en dos aplicaciones principales:

- 1. el desarrollo de cepas aviares que presentan unos caracteres genéticos determinados (resistencia a ciertas enfermedades, rendimientos de crecimiento, etc.)

- 2. el desarrollo de sistemas de producción de proteínas recombinantes en el albumen del huevo.

La industria biotecnológica se interesa cada vez más en la posibilidad de producir unas proteínas de interés en unos fluidos biológicos o unos organismos (sangre, leche, plantas, etc.). La producción de dichas proteínas en el huevo de pájaro doméstico constituirá seguramente en esta vía un avance tecnológico principal por varias razones:

- numerosas proteínas de mamíferos no pueden ser producidas en sistema mamífero puesto que su superabundancia en estos organismos presenta unos efectos deletéreos (ejemplo; la eritropoyetina que en el conejo induce unas hiperglobulinemias patológicas). Muchas de estas proteínas de interés no presentan ninguna actividad cruzada con las de los pájaros, permitiendo así su superproducción en un organismo aviar sin efecto patológico mayor;

- es muy posible que la comercialización de proteínas recombinantes producidas en unos mamíferos se enfrentará a unos problemas sanitarios relacionados con la presencia en esta especie de organismos latentes potencialmente patógenos para el ser humano (lentivirus, priones, etc.). Este riesgo es muy mínimo, por no decir casi inexistente, para unos agentes patógenos de los pájaros domésticos;

- el huevo constituye un "tejido" muy denso en un pequeño número de proteínas. Por ejemplo, la proteína principal del huevo de pájaro, la ovoalbúmina representa 54% de las proteínas de la clara de huevo, es decir un peso seco medio por huevo de 2 gramos de materia seca aproximadamente. Se puede imaginar razonablemente producir por huevo por lo menos 10% de esta masa en proteína recombinante. La rentabilidad económica aparece muy elevada si se considera que una gallina pone como media 2 huevos cada tres días, y esta rentabilidad aparece muy superior a la de grandes mamíferos si se consideran los costes de cría mucho menores de los pájaros domésticos.

La realización de pájaros transgénicos es posible actualmente con un coste extremadamente elevado a causa de su eficacia tan baja. En efecto, en los pájaros, la técnica de microinyección de ADN en el huevo es casi imposible. Por otro lado, la utilización del sistema de los retrovirus vectores, el único sistema eficaz hoy en día, sigue siendo complejo y se enfrenta ciertamente a una reticencia por parte de los industriales por razones sanitarias.

Un avance muy importante para la realización de animales transgénicos ha sido aportado en el ratón por el desarrollo de la tecnología de las células ES.

Las células ES (por Embryonic Stem cells) son unas células embrionarias totipotentes capaces de regenerar todos los tejidos del embrión, incluyendo el tejido germinal, después de su inyección en unos embriones muy precoces. Estas células pueden ser consideradas por lo tanto como unos caballos de Troya para inducir nuevas informaciones genéticas en el patrimonio genético de un animal. La posibilidad de cultivar estas células a largo plazo in vitro, ofrece la posibilidad de ejercer numerosos controles antes de su implantación in vivo. Por otra parte, estas células pueden ser conservadas de manera ilimitada en el nitrógeno líquido, lo cual constituye una posibilidad de almacenamiento de un patrimonio genético.

El uso de células ES constituye hoy en día en los pájaros domésticos, la vía más prometedora para la realización eficaz de animales transgénicos.

La solicitud WO 93/23528 da a conocer un medio de cultivo para las células ES aviares que contienen LIF. (Leukemia Inhibitory Factor).

Unos trabajos recientes de un grupo canadiense (R. Etches en la estación de Guelph) han sugerido que unas células ES deben existir en el embrión de pájaro (Petitte et al., 1990). Este grupo ha conseguido el trasplante de dichas células en unos embriones, y a continuación, la producción de animales cuyo patrimonio genético se deriva de las células injertadas. Sin embargo, en la actualidad, no se ha podido conseguir el cultivo de estas células in vitro; por consiguiente, estas células no han podido ser utilizadas para transferir de manera estable un transgén.

Constituye un bloqueo principal para la explotación de la técnica de las células ES en los pájaros. Las células ES pueden ser caracterizadas por tres tipos de criterios esenciales:

- morfología

- actividad fosfatasa alcalina endógena

- reacción con unos anticuerpos específicos de un estado de totipotencia (ECMA-7, SSEA-1 y SSEA-3 en particular).

No se ha podido obtener hasta ahora ningún cultivo de células ES identificadas por el conjunto de estas características.

Por eso, la presente invención tiene por objeto un medio de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares del tipo que comprende un medio de cultivo para células aviares.

Llegado el caso, el medio de cultivo está sustancialmente desprovisto de ácido retinoico activo.

De manera ventajosa, el ácido retinoico está sustancialmente desactivado por unos anticuerpos anti-ácido retinoico (ARMA) presentes en el medio.

En efecto, los medios utilizados contienen frecuentemente suero, del cual no se puede controlar la cantidad endógena de ácido retinoico. Ensayando el efecto de la incorporación al medio de cultivo de un anticuerpo monoclonal anti-ácido retinoico que neutralizaría la acción de este último, sobre la diferenciación de las células, el solicitante ha constatado que la presencia de este anticuerpo aumenta la presencia en los cultivos de células y colonias con actividad fosfatasa alcalina.

Más específicamente, la presente invención tiene por objeto un procedimiento de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares (o células ES aviares), caracterizado porque:

1) Se suspenden unas células que proceden de discos blastodérmicos de huevos de pájaros fecundados en un

medio de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares, del tipo que comprende un medio de cultivo para

células aviares, que comprende:

a) b-FGF, SCF y LIF, o

b) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF, IL-11, IL-6, e IGF-1, o

c) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF e IGF-1.

(bFGF = basic Fibroblast Growth Factor; SCF = Stem Cell Factor; LIF = Leukemia lnhibitory Factor; IL11 = Interleukin 11; IL6 = Interleukin 6; IGF-1 = Insulin-like Growth Factor-1; aSCF = avian Stem Cell Factor)

2) Se inocula un tapiz de células nutricias con la suspensión obtenida al final de la etapa a),

3) Se ponen las células a incubar,

4) Las células en cultivo son extraídas y purificadas con el fin de recuperar unas células ES aviares.

Ventajosamente, en el procedimiento de cultivo según la invención entre las etapas 3) y 4), se efectúan una o varias adiciones escalonadas en el tiempo de medio nuevo idéntico al utilizado en la etapa 1).

Ventajosamente, en el procedimiento de cultivo según la invención, el medio de cultivo está esencialmente desprovisto de ácido retinoico activo.

Ventajosamente, en el procedimiento de cultivo según la invención, el medio de cultivo comprende un tapiz de células nutricias.

Ventajosamente, en el procedimiento de cultivo según la invención entre las etapas 3) y 4), se efectúa la adición de medio nuevo al 3º día, y después todos los días.

Ventajosamente, en el procedimiento de cultivo según la invención, la etapa 4) se efectúa mediante un tratamiento enzimático, lavado en un medio que no contiene ningún factor de crecimiento y centrifugación.

Ventajosamente, en el procedimiento de cultivo según la invención al final de la etapa 4), se efectúa una etapa 5) en la que las células... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares (o células ES aviares), caracterizado porque:

1) Se suspenden unas células que proceden de discos blastodérmicos de huevos de pájaro fecundados en un medio de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares, del tipo que comprende un medio de cultivo para células aviares, que comprende:

a) b-FGF, SCF y LIF, o b) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF, IL-11, IL-6, e IGF-1, o c) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF e IGF-1.

(bFGF = basic Fibroblast Growth Factor; SCF = Stem Cell Factor; LIF = Leukemia lnhibitory Factor; IL11 = Interleukin 11; IL6 = Interleukin 6; IGF-1 = Insulin-like Growth Factor-1; aSCF = avian Stem Cell Factor)

2) Se inocula un tapiz de células nutricias con la suspensión obtenida al final de la etapa a),

3) Se ponen las células a incubar,

4) Las células en cultivo son extraídas y purificadas con el fin de recuperar unas células ES aviares.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque entre las etapas 3) y 4) se efectúa una o varias adiciones escalonadas en el tiempo, de medio nuevo idéntico al utilizado en la etapa 1).

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el medio de cultivo está esencialmente desprovisto de ácido retinoico activo.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el medio de cultivo comprende un tapiz de células nutricias.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque entre las etapas 3) y 4) se efectúa la adición del medio nuevo al 3er día, y después todos los días.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa 4) se efectúa mediante tratamiento enzimático, lavado en un medio que no contiene ningún factor de crecimiento y centrifugación.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque al final de la etapa 4) se efectúa una etapa 5) en la que las células ES son re-inoculadas sobre un tapiz de células nutricias, en presencia de dicho medio de cultivo, de manera que se obtenga un cultivo secundario.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque las etapas 4) y 5) se repiten varias veces.

9. Cultivo de células ES aviares in vitro susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo dicho cultivo un medio de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares que comprende:

a) b-FGF, SCF y LIF, o b) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF, IL-11, IL-6, e IGF-1, o c) b-FGF, aSCF (avian SCF), LIF e IGF-1.

(bFGF = basic Fibroblast Growth Factor; SCF = Stem Cell Factor; LIF = Leukemia lnhibitory Factor; IL11 = Interleukin 11; IL6 = Interleukin 6; IGF-1 = Insulin-like Growth Factor-1; aSCF = avian Stem Cell Factor)

10. Cultivo de células ES aviares según la reivindicación 9, caracterizado porque presenta 2 a 3 veces más de colonias positivas para la actividad alcalina fosfatasa con respecto al fondo constituido en su mayor parte por células poco positivas.

11. Cultivo de células ES aviares según la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque las células reaccionan específicamente con por lo menos un anticuerpo seleccionado de entre ECMA-7, SSEA-1, SSEA-3, TEC-01, EMA-1 y EMA-6.

12. Cultivo de células ES aviares según la reivindicación 11, caracterizado porque las células no reaccionan con el anticuerpo TROMA-1.

13. Cultivo de células ES aviares según una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque las células son modificadas por la integración del gen que codifica para una proteína heteróloga.