PROTEÍNAS SECRETADAS COMO MARCADORES PARA LA DIFERENCIACIÓN CELULAR.

Proteínas secretadas como marcadores para la diferenciación celular Campo de la invención La presente invención se refiere al uso de proteínas capaces de ser secretadas a través de la membrana celular como informadors específicos según el tipo celular durante el desarrollo celular. Más detalladamente, la presente invención se refiere a células madre embrionarias (ES) transfectadas con un constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína secretada que se une de forma específica a un promotor dependiente de la célula y/o del desarrollo; un método para preparar dichas células ES; un cultivo celular que puede obtenerse cultivando dichas células ES; un método para el análisis toxicológico de sustancias usando dichos cultivos celulares, así como a métodos para la identificación de factores de diferenciación y crecimiento para la inducción de células selectivamente diferenciadas que pueden usarse como fuente para injertos de tejidos; un método para producir mamíferos no humanos transgénicos usando dichas células ES; un mamífero no humano transgénico que puede obtenerse mediante dicho método; y a un método para examinar las etapas de desarrollo celular usando células de dicho mamífero no humano. La presente invención también se refiere a análisis para identificar condiciones de cultivo y a las sustancias que promueven la diferenciación en el tipo celular deseado, o para determinar la toxicidad de un compuesto en ciertos tipos celulares. Dichos análisis son especialmente adecuados como indicadores de posibles trastornos en el desarrollo y diferenciación durante la embriogénesis. Técnica anterior ES 2 365 786 T3 Las células precursoras se han convertido en objeto de interés en la investigación médica. Por una parte, los precursores pueden remplazar las células senescentes o dañadas por heridas o enfermedades y, por otra parte, estas células representan un modelo ideal para estudiar el desarrollo y diferenciación y los factores que influencian dichos procesos. El uso de líneas celulares convencionales en estos estudios presentan el inconveniente de que las líneas celulares individuales pueden no ser totalmente representativas de las complejas características biológicas de un organismo intacto. Además, incluso repitiendo los análisis en múltiples líneas celulares, no se reproducen o explican las complejas interacciones entre células y tejido que tienen lugar en un organismo. Esta es la razón principal por la cual el análisis de toxicidad en las líneas celulares no puede reemplazar los análisis convencionales en animales. Continuamente se están desarrollando y ensayando sobre animales nuevos compuestos químicos. Además de los compuestos químicos de uso industrial y doméstico, cada año se desarrollan diferentes sustancias químicas para usar como medicamentos. La administración de medicamentos y alimentos de los EE.UU. (FDA) promulga normas relativas al análisis de fármacos potenciales que actualmente exigen llevar a cabo análisis muy completos de toxicidad, capacidad mutagénica y otros efectos en, al menos, dos especies antes de que una sustancia prevista como posible medicamento pueda acceder a la realización de análisis clínicos en humanos. La realización de análisis de toxicidad preclínicos cuesta varios cientos de miles de dólares. A pesar de esta enorme inversión, casi una tercera parte de todas las sustancias terapéuticas candidatas para el uso en humanos no superan la primera fase de los análisis clínicos en humanos debido a que presentan una toxicidad no prevista. Está claro que los análisis exhaustivos de evaluación toxicológica disponibles en la actualidad no detectan todos los efectos tóxicos asociados con la terapia en humanos o con la exposición a sustancias químicas presentes en el entorno. La disponibilidad de mejores medios de evaluación exhaustiva de sustancias candidatas a uso terapéutico o sustancias químicas en general para determinar su posible toxicidad reduciría el coste e incertidumbre relacionados con el desarrollo de nuevas sustancias terapéuticas y materiales, por ejemplo, para el uso en dispositivos médicos o en otros dispositivos o productos de consumo a los cuales están expuestos los seres humanos diariamente. La detección de las propiedades teratogénicas y/o embriotóxicas de los agentes químicos se lleva a cabo en la actualidad mediante la determinación de la toxicidad reproductiva de sustancias sometidas a análisis tras ser administradas en dosis únicas o múltiples a mamíferos de laboratorio en estado de gestación y mediante análisis de la toxicidad embrionaria en las etapas iniciales de la gestación. Además, se realizan análisis in vitro con embriones de mamíferos (Neubert y Merker, de Gruyter, Berlin-Nueva York (1981)) y con órganos embrionarios para análisis de teratogenicidad. Estos procedimientos de análisis presentan, sin embargo, el inconveniente de que requieren el uso de una gran cantidad de mamíferos vivos, especialmente de ratas y ratones. Los procedimientos para análisis in vitro en los que se emplean principalmente cultivos celulares de yemas de extremidades (por ejemplo, Limb Buds, Kochhar, Teratology 11 (1975), 273-287), o partes del cerebro de ratas embrionarias (Flint y Orton, Toxicol. Appl. Pharmacol. 45 76 (1984), 383-395) o líneas celulares estables de tejido de mamífero embrionario o adulto como, por ejemplo, células tumorales del ovario o células palatales embrionarias no satisfacen, en sentido estricto, los 2 ES 2 365 786 T3 requerimientos que se imponen a los análisis de teratogenicidad durante la embriogénesis, ofreciendo indicios de posible disgénesis o trastornos en el desarrollo. Se han realizado esfuerzos durante unos años para emplear cultivos permanentes de células madre embrionarias (células ES) para la detección de sustancias embriotóxicas y mutagénicas; véase, p. ej., Laschinski y col., Reproductive Toxicol. 5 (1991), 57-65; Newall y Beedles, Toxicol, in Vitro 8 (1994), 697-701; Sehlmeyer y Wobus, Mutation Res. 324(1994), 69-76. Todos estos sistemas hacen uso de las propiedades biológicas de las células ES de análisis o de un sistema reportero que ha sido introducido en las células. Por ejemplo, US-A-6.498.018 describe un método para determinar el efecto de un agente biológico poniendo en contacto un cultivo celular con un agente biológico. El cultivo celular contiene células madre neuronales del sistema nervioso central (SNC) multipotentes humanas obtenidas de tejido neural del SNC primario y un medio de cultivo con factores de crecimiento previamente seleccionados. La lectura de salida se proporciona mediante el efecto de un agente biológico en presencia o en ausencia de una función o propiedad biológica que puede atribuirse al cultivo celular. Un inconveniente importante de este sistema es el hecho de que resulta difícil medir funciones o propiedades biológicas específicas inherentes a un determinado cultivo de células y, a menudo, supone la destrucción de una gran parte del cultivo para obtener suficiente material para el análisis. WO02/086073 describe un método para la selección positiva de células neuronales diferenciadas a partir de células madre embrionarias obtenidas por transferencia nuclear aprovechando la nectina como marcador de células madre neurales. Este método se limita a tipos celulares neuronales que expresan nectina de modo natural. US-A-6.007.993 describe un procedimiento de análisis in vitro para la detección de efectos embriotóxicos (por ejemplo, teratogénicos) químicamente inducidos basados en células madre (ES) embrionarias pluripotentes diferenciadas de ratón y de rata, usando células embrionarias germinales (EG) establecidas a partir de células germinales primordiales. Se construyen clones estables de células madre ES o EG transgénicos en donde un gen informador bacteriano, LacZ o el gen luciferasa, se pone bajo el control de promotores específicos para un tejido determinado o genes de control del desarrollo. Después de la diferenciación de las células ES en presencia de sustancias teratogénicas en los diferentes derivados de ruta de germinación se produce una expresión dependiente de la diferenciación en las células, debido a la actividad de los promotores específicos para el tejido. La activación, represión o modulación de estos genes específicos de tejido se detecta a partir de una reacción que depende del gen informador empleado, por ejemplo, el análisis X-Gal. Wobus y col., J. Mol. Cell. Cardiol. 29 (1997), 1525-1539 describe un método para el seguimiento de la diferenciación celular incluyendo el cultivo de células madre embrionarias (ES) capaces de diferenciarse y formar cuerpos embrioides que contienen una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un gen informador que codifica el gen lacZ bajo el control de la región... [Seguir leyendo]

1. Un método para hacer el seguimiento de la diferenciación celular que comprende: cultivo de células capaces de diferenciarse en, al menos, un tipo celular específico que contiene, al menos, una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un gen informador que codifica un producto que se secreta tras la diferenciación celular, o mantener un animal no humano que comprende dichas células bajo condiciones que permiten la diferenciación de las células; y cuantificar las células diferenciadas determinando la cantidad o actividad del producto génico informador en un fluido corporal de dicho animal no humano transgénico o en el medio de cultivo celular. 2. El método de la reivindicación 1 en donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende, al menos, una secuencia reguladora con especificidad para el tipo celular unida de modo operable a dicho gen informador. 3. El método de la reivindicación 1 ó 2 en donde dichas células son, o se derivan de, células madre. 4. El método de la reivindicación 3 en donde dichas células madre son células de una línea de células madre embrionarias o células progenitoras adultas multipotentes (MAPC). 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en donde dicho producto génico informador comprende una secuencia secretora candidata a fármaco. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-5 en donde dicha secuencia reguladora comprende un elemento promotor y/o potenciador. 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en donde dicho tipo celular se selecciona del grupo que consiste en fibroblastos del tejido conectivo, células estromales, células endoteliales, células gliales, células neurales, células neuronales, células hematopoyéticas, células de músculo liso, células de músculo esquelético, células epiteliales y células cardíacas. 8. El método de la reivindicación 6 ó 7 en donde dicho promotor o potenciador se selecciona del grupo que consiste en promotor o potenciador MHC, MLC2V, VE-cadherina, Tie-2, Flk-1, Flt-1, GFAP, tubulina alfa-1 y colágeno 2. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en donde dicho producto génico informador es fosfatasa alcalina secretada (SEAP) o alfa-amilasa. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en donde dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende un marcador que puede seleccionarse expresado mediante células multipotentes o pluripotentes. 11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en donde dichas células forman agregados celulares o agregados de tipo tisular derivados de tipos celulares diferentes. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en donde dichas células forman cuerpos embrioides (EB). 13. Un constructo génico informador para hacer el seguimiento de la diferenciación celular cuantificando las células diferenciadas que comprenden una molécula de ácido nucleico recombinante según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5, 6 ó 8-10. 14. Una célula que comprende un constructo génico informador de la reivindicación 13 en donde dicha célula es capaz de diferenciarse en, al menos, un tipo celular concreto. 15. Un agregado celular de, al menos, un tipo celular que comprende células de la reivindicación 14. 16. Un tejido que comprende células de la reivindicación 14 o un agregado celular de la reivindicación 15. 17. Un órgano que comprende un tejido de la reivindicación 16, una célula de la reivindicación 14 o un agregado celular de la reivindicación 15. 18. Un implante o trasplante que comprende un órgano de la reivindicación 17, un tejido de la reivindicación 16, una célula de la reivindicación 14 o un agregado celular de la reivindicación 15. 39 ES 2 365 786 T3 19. Un animal no humano que comprende un constructo génico informador de la reivindicación 13, una célula de la reivindicación 14, un agregado celular de la reivindicación 15, un tejido de la reivindicación 16 o un órgano de la reivindicación 17. 20. Una composición de materia que comprende un constructo génico informador de la reivindicación 13, un tejido de la reivindicación 16, células de la reivindicación 14 o un agregado celular de la reivindicación 15. 21. Un array que comprende un soporte sólido y, unido al mismo, o suspendido sobre el mismo, células de la reivindicación 14, un agregado celular de la reivindicación 15 o un tejido de la reivindicación 16. 22. Uso de un aparato para analizar el array de la reivindicación 21. 23. Un método de obtención y/o perfilado de un modulador de la diferenciación celular que comprende: poner en contacto una muestra de análisis que comprende una célula de la reivindicación 14, un agregado celular de la reivindicación 15, un tejido de la reivindicación 16 o un órgano de la reivindicación 17 o un animal no humano de la reivindicación 19 con una sustancia de análisis; y determinar el efecto de la sustancia de análisis en la cantidad del producto génico informador o actividad en comparación con una muestra o animal de control. 24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 ó 23 en donde se añade al medio de cultivo o al animal un compuesto que se sabe que activa o inhibe el proceso de diferenciación. 25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24 en donde la sustancia de análisis es un agente terapéutico o una mezcla de agentes terapéuticos. 26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23-25 que se realiza en un array. 27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 ó 23-26 en donde dicha una o más células se manipulan genéticamente para (sobre)expresar o inhibir la expresión de un gen diana. 28. Un kit útil para llevar a cabo un método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 ó 23-27 que contiene un constructo génico informador de la reivindicación 13 o una célula de la reivindicación 14 y, opcionalmente, compuestos estándar, como medios de cultivo, agentes de selección, agentes de detección para la molécula informadora y muestras de control. 29. Uso de un constructo génico informador de la reivindicación 13, una célula de la reivindicación 14, un agregado celular de la reivindicación 15, un tejido de la reivindicación 16, un órgano de la reivindicación 17, el implante o trasplante de la reivindicación 18, un animal no humano de la reivindicación 19, la composición de la reivindicación 20 o un array de la reivindicación 21 en el descubrimiento de medicamentos o en el perfilado famacocinético o farmacológico. 30. Un vector que comprende la región promotora del gen de cadena pesada de alfa-miosina de ratón o del gen de cadena ligera del regulador de miosina ventricular y unida de modo operable a la misma una secuencia de ADN heteróloga que codifica la proteína fosfatasa alcalina secretada (SEAP). 31. El vector de la reivindicación 30 en donde dicho promotor comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1 ó 2, o un fragmento de la misma. 32. El vector de la reivindicación 30 ó 31 que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 3. 33. Uso de una región promotora del gen de cadena pesada de alfa-miosina de ratón o del gen regulador de la cadena ligera de miosina ventricular para la expresión específica de secuencias de ADN heterólogas durante la embriogénesis o desarrollo celular en un método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 ó 23-27. Actividad SEAP (porcentaje de control) ES 2 365 786 T3 Concentración de Ácido Retinoico 41