ANIMAL TRANSGÉNICO IL-18.

La presente invención se refiere a animales transgénicos útiles como modelos en animales de dermatitis tópica, especialmente la dermatitis atópica crónica. Antecedentes Las enfermedades atópicas, tales como dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica y conjuntivitis alérgica, son enfermedades que responden con hipersensibilidad a antígenos ambientales o similares a los que los sujetos normales no responden, y desarrollan la destrucción o alteración de varios órganos por su propio sistema inmunitario. Se supone que las citocinas Th2 que potencian las respuestas alérgicas desempeñan un papel en el mecanismo de inicio de estas enfermedades. La aclaración de sus mecanismos de inducción y reguladores tiene un significado importante desde los puntos de vista de fisiología y farmacología, pero estos mecanismos todavía no se han aclarado con detalle. Actualmente se sabe que los tratamientos de las enfermedades atópicas incluyen principalmente aquéllos que dependen de la evitación de antígenos o del uso de antihistamínicos que compiten con la unión de mediadores tales como la histamina a los receptores o de agentes antiinflamatorios esteroideos. No obstante, el desarrollo de procedimientos terapéuticos dirigidos a mecanismos de acción más específicos se ha dificultado debido a la falta de animales de laboratorio adecuados. Convencionalmente, la inducción de una respuesta alérgica en un animal de laboratorio ha requerido la administración al animal de un antígeno o alérgeno después de sensibilizar al animal con antelación mediante inmunización repetida del animal con el antígeno o alérgeno. No obstante, en este caso, la sensibilización simultánea de muchos animales requiere una gran cantidad de trabajo y, además, puede producir variaciones en la reactividad entre cada animal individual, lo que conduce a un problema en la reproducibilidad de un experimento. En los últimos años. Los ratones NC/Nga están atrayendo interés como animal modelo para la dermatitis atópica. La dermatitis que se produce en este ratón conduce a su inicio por primera vez en presencia de ácaros y, además, su velocidad de inicio es inestable y sus síntomas varían. Los animales de laboratorio son indispensables para el desarrollo de medicamentos para enfermedades atópicas, lo que conduce a un fuerte y excepcional deseo de, especialmente, animales modelo para la dermatitis atópica. No obstante, actualmente no se dispone de ningún modelo animal de dermatitis atópica ni proporcionado para uso práctico, que se haya establecido en los antecedentes genéticos, se haya definido inmunológicamente y se pueda usar para el desarrollo e investigación de varios procedimientos terapéuticos y fármacos en condiciones específicas sin patógenos. Por tanto, un objeto de la presente invención es crear un animal útil como modelo de dermatitis atópica. Divulgación de la invención Por consiguiente, los presentes inventores se interesaron en la interleucina 18 (IL-18). La IL-18 está sometida a procesamiento por una proteasa denominada "caspasa 1" (enzima convertidora de IL-1ß) y se convierte desde el tipo precursor en el tipo maduro. Se sabe que las funciones de la IL-18 madura incluyen (1) inducción de producción de IFN-, (2) potenciación de la apoptosis mediada por Fas mediante la potenciación del ligando de Fas y la expresión, (3) inducción de GM-CSF y (4) inhibición de la producción de IgE mediante la co-existencia de IL-12. Además, la IL-18 también se expresa en varios tejidos distintos a los tejidos inmunológicos, tales como células intersticiales de tipo osteoblasto, queratinocitos, células epiteliales intestinales, células adrenocorticales y pituicitos, y se ha estado realizando una investigación activa sobre sus papeles fisiológicos [véase Men-eki (Immunology) 1997- 98, 62-72, Nakayama-Shoten Co., Ltd.; Rinsho Men-eki (Clinical Immunology) 30(2), 191-198 (1998); etc.]. En los últimos años, los presentes inventores han encontrado que, cuando la IL-18 se sobreexpresa únicamente, la producción de la IL-4 y la IL-13 se potencia para inducir la producción de IgE. Esto significa que la IL-18 está estrechamente relacionada con una citocina Th2 que desempeña un papel al inicio de una enfermedad atópica. Por tanto, los presentes inventores consideraron que la creación de modelos animales con secreción estimulada de caspasa 1, que convierte la IL-18 en el tipo maduro, sería útil para la aclaración de los mecanismos de inicio de enfermedades atópicas y el desarrollo de procedimientos de tratamiento para enfermedades atópicas. No obstante, la caspasa 1 es una enzima inductora de apoptosis y, por tanto, se acompaña del problema de que cuando se expresa en un cuerpo vivo a través de la introducción de su gen, no sólo se produce secreción de IL-18 sino también se desarrollan efectos apoptóticos. Desde el punto de vista anterior, los presentes inventores crearon un mamífero no humano transgénico con un ADN 2 E02745959 17-11-2011   incorporado de modo que el gen de la caspasa 1 se expresa específicamente en la piel, y han presentado una solicitud de una patente del mismo (documento WO 01/95710 A1). Este animal transgénico muestra los síntomas de dermatitis atópica y es útil como modelo de animal. No obstante, este animal transgénico también desarrolló un síntoma de necrosis de células epidérmicas y mostró el síntoma de dermatitis de fase aguda y, en algunos casos, desarrolló hepatopatía sistémica tras infección por bacterias. Como resultado de una investigación adicional, actualmente los presentes inventores han encontrado que la introducción directa de un ADN, obtenido mediante recombinación de la IL-18 madura de modo que la IL-18 madura se exprese específicamente en la piel, en un animal transgénico posibilita producir un animal transgénico que secreta de forma continua IL-18 madura en sangre y desarrolla el síntoma de dermatitis atópica, incluso cuando se produce en condiciones en las que se han excluido patógenos específicos, como ácaros y hongos, y, asimismo, y también que, inesperadamente, el animal transgénico carece de síntomas de necrosis de células epidérmicas y hepatopatía, y es útil como modelo de animal de dermatitis atópica más cercana a la dermatitis atópica humana, lo que conduce a la finalización de la presente invención. Específicamente, la presente invención proporciona un ratón transgénico que secreta de forma continua IL-18 madura en sangre y desarrolla continuamente dermatitis atópica, como se define adicionalmente en la reivindicación 1. La presente invención proporciona además un procedimiento de detección selectiva de una sustancia para prevenir o tratar la dermatitis atópica, que comprende administrar a un ratón transgénico una sustancia problema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para comprobar su efecto de mejora de la dermatitis atópica. Breve descripción de las figuras La FIG.1 ilustra esquemáticamente la estructura de unión de un ADN recombinante usado para la introducción. La FIG. 2 muestra mediante electroforetograma los resultados de la expresión de ARNm de IL-18 madura (mIL-18) en el tejido epidérmico del oído de ratón transgénico de IL-18 específica de queratinocitos (KI-18Tg), según se analiza mediante transferencia de tipo Northern. La FIG. 3 presenta mediante electroforetograma la expresión de ARNm de mIL-18 en el tejido epidérmico de oído de KIL-18Tg según se analiza mediante PT-PCR. La FIG. 4 representa mediante histograma los cambios en los niveles séricos de IL-18 en KIL-18Tg, ratón transgénico con caspasa-1 específica de queratinocitos (KPASP1Tg) y el silvestre (SIL) a las 12 semanas y 36 semanas del nacimiento. La FIG. 5 muestra mediante histograma los resultados de la prueba del número de rascados en la piel realizados por los ratones KIL-18Tg, KCASP1Tg y silvestre (SIL). La FIG. 6 muestra mediante histograma los niveles plasmáticos de IgE en ratones KIL-18Tg, KCASP1Tg y silvestre (SIL) (a las 36 semanas). Mejores modos de llevar a cabo la invención El ratón transgénico de acuerdo con la presente invención comprende un ADN incorporado en sus células somáticas o células germinales, de modo que un gen de IL-18 exógena se expresa específicamente en la piel. Como gen de la IL-18 exógena, se prefiere un gen de IL-18 humano o de ratón. Son ilustrativos los genes tales como de IL-18 madura humana (hIL-18), de IL-18 de ratón maduro (mIL-18), IL-18 precursora humana (hproIL-18) e IL-18 precursora de ratón (mproIL-18). Se prefiere la h1L-18 ormIL-18, siendo particularmente preferidos los ADNc de 0,63 kb de la región codificadora completa de la mIL-18. Como ADN con el gen de la IL-18 exógena incorporado en el mismo de modo que el gen de la IL-18 exógena se expresa de forma específica se usa un ADN recombinante que contiene el gen de la IL-18... [Seguir leyendo]

1. Un ratón transgénico que secreta de forma continua IL-18 madura en sangre y que desarrolla de forma continua dermatitis atópica, que comprende un ADN en el que una secuencia líder de hormona preproparatiroidea ligada a un gen de la IL-18 está ligada en una posición posterior de un promotor de queratina 14, de modo que dicho gen de IL- 18 exógena se expresa de forma específica. 2. Un ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ADN recombinante contiene además un intrón de ß-globina y una poli A de queratina. 3. Un ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que no desarrolla prácticamente necrosis de células epidérmicas ni hepatopatía. 4. Un procedimiento de detección selectiva de una sustancia para prevenir o tratar la dermatitis atópica, que comprende administrar a un ratón transgénico una sustancia de prueba de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para comprobar su efecto de mejora de la dermatitis atópica. 8 E02745959 17-11-2011   9 E02745959 17-11-2011   E02745959 17-11-2011   11 E02745959 17-11-2011   12 E02745959 17-11-2011