Un procedimiento para identificar y/u obtener un fármaco para la mejora o tratamiento de una cardiopatía o para determinar la toxicidad de un compuesto que comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende una célula diferenciada in vitro con una sustancia de ensayo que se va a cribar, en el que en dicha célula se induce la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula de una célula, tejido u órgano enfermos; y (b) determinar un cambio sensible del fenotipo en dicha muestra de ensayo, en el que un cambio sensible (i) que evite o retrase el inicio o la progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de un fármaco útil; y (ii) si potencia el inicio o progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de la toxicidad del compuesto; en el que dicha célula diferenciada in vitro es un cardiomiocito y dicho fenotipo es un fenotipo hipertrófico cardiaco

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo técnico de los ensayos celulares para identificar y/o obtener un fármaco para la mejora o tratamiento de una enfermedad o para determinar la toxicidad de un compuesto determinado. En concreto, la presente 5 invención se refiere a un procedimiento para identificar y/o obtener un fármaco para la mejora o tratamiento de una enfermedad o para determinar la toxicidad de un compuesto que comprende poner en contacto una muestra de ensayo que comprende una célula diferenciada in vitro con una sustancia de ensayo que se va a cribar, en el que se induce la expresión en dicha célula de un fenotipo de enfermedad predefinido 10 que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula, tejido u órgano enfermos; y determinar un cambio sensible del fenotipo en dicha muestra de ensayo, en el que un cambio sensible que evite o retrase el inicio o la progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de un fármaco útil y si potencia el inicio o progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de la toxicidad del compuesto. El procedimiento de la 15 presente invención se usa, preferiblemente, con embriocitos indiferenciados y, en general, se puede aplicar para la identificación de efectos protectores de cualquier compuesto terapéutico prometedor y también para determinar potenciales efectos secundarios que pueda tener un compuesto determinado para un sujeto que padezca una enfermedad concreta. El ensayo de la presente invención es especialmente 20 adecuado para cribar la capacidad de una sustancia de mejorar una cardiomiopatía. Además, la presente invención se refiere a kits y a un equipo para realizar el ensayo celular de la invención y para analizar los resultados así obtenidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La cardiopatía es uno de los problemas de salud más graves del mundo 25 occidental. Se estima que 61 millones de americanos (casi 1 de cada 5 hombres y mujeres) tienen uno o más tipos de enfermedad cardiovascular (National Health and Nutrition Examination Survey III, 1988-1994, Center of Disease Control and the American Heart Association). Afecciones extendidas incluyen la enfermedad coronaria cardiaca (12,4 millones), defectos cardiovasculares congénitos (1 millón) e 30 insuficiencia cardiaca congestiva (4,7 millones). Un reto primordial en investigación en medicina regenerativa es identificar y desarrollar fármacos que puedan ayudar a reconstituir la función cardiaca en estas afecciones.

El desarrollo de nuevos fármacos es obstaculizado por la falta de sistemas

celulares in vitro adecuados que se asemejen a tejido enfermo, por ejemplo, células cardiacas miopáticas. Diversos intentos de obtener miocitos cardiacos inmortalizados se describen en los documentos Sen y col., J. Biol. Chem. 263 (1988), 19132-19136; Gartside y Hauschka en “The Development and Regenerative Potential of Cardiac Muscle”, eds. Oberpriller y col., Harwood, New York, 1991, 7941-7948; Jaffredo y 5 col., Exp. Cell. Res. 192 (1991), 481-491; Wang y col., In Vitro Cell Dev. Biol. 27 (1991), 63-74; Katz y col., Am. J. Physiol. 262 (1992), 1867-1876); Engelmann y col., J. Mol. Cell Cardiol. 25 (1993), 197-213; Borisov y Claycomb, Ann. NY Acad. Sci. 752 (1995), 80-91; Jahn y col., J. Cell Sci. 109 (1996), 397-407. Sin embargo, el fenotipo cardiaco de las células así obtenidas bien no es estable o bien las células 10 pierden su capacidad de proliferar. Además, se ha descrito una línea celular de cardiomiocitos auriculares inmortalizados murinos que mantiene características de diferenciación y capacidad de proliferación durante un periodo de tiempo mayor (Claycomb y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 95 (1998), 2979-2984).

A menudo se usan preparaciones de células cardiacas aisladas de ratón o rata 15 como un sistema modelo de cardiopatía in vitro basado en cardiomiocitos no transformados; véase el documento Chlopcikova y col., Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 145 (2001), 49-55. Estas células mantienen su fenotipo diferenciado sólo durante unos días. Además, estos cultivos primarios no son homogéneos sino que contienen diferentes tipos de células y varían para cada 20 preparación. Un problema concreto consiste en la contaminación de los cardiomiocitos por otros tipos de células presentes en el corazón, en concreto fibroblastos, los cuales, al contrario que los cardiomiocitos que no están en división, proliferan en gran medida y no se pueden eliminar completamente del cultivo. Algunos receptores expresados por los cardiomiocitos, así como por células diferentes a los cardiomiocitos y los 25 cardiomiocitos, segregan moléculas que interactúan con receptores de células diferentes a los cardiomiocitos, así como viceversa, células diferentes a los cardiomiocitos segregan moléculas que se unen a receptores de cardiomiocitos.

Por consiguiente, en vista de la preparación bastante laboriosa de células de tejido u órganos, que podrían servir como sistema modelo para un fenotipo de 30 enfermedad in vitro, todavía se usan modelos de animales transgénicos tales como el modelo de animal transgénico de insuficiencia cardiaca descrito en la solicitud internacional WO97/36477 o para una cardiopatía humana descrito en la solicitud de patente alemana DE19815128. Recientemente, se ha descrito un modelo de animal

transgénico para producir hipertrofia cardiaca en ratones transgénicos en la patente estadounidense nº 6.657.104.

El documento WO03/006950 propone el uso de cardiomiocitos que se han diferenciado in vitro para el cribado de fármacos para la mejora o tratamiento de una enfermedad, en el que los cardiomiocitos deberían tener las características de los 5 cardiomiocitos que se encuentran en el tejido cardiaco nativo.

El documento WO03/080816 enseña que las células diferenciadas in vitro se pueden modificar para expresar un fenotipo deseado de estirpes de citoblastos y células diferenciadas que se encuentran en el cuerpo.

Sin embargo, estos procedimientos de ensayo tienen la desventaja de que 10 requieren el uso de un gran número de mamíferos vivos, en concreto ratas y ratones, y, obviamente, no conducen a un cribado de elevada productividad.

Por tanto, hay necesidad de sistemas de ensayo celular in vitro que se puedan llevar a cabo fácilmente y proporcionen resultados fiables. La solución a dicho problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las 15 reivindicaciones y descritas adicionalmente a continuación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las realizaciones según se caracterizan en las reivindicaciones. Se desvela un procedimiento para identificar y/o obtener un fármaco para la mejora o tratamiento de una enfermedad o para determinar la toxicidad 20 de un compuesto que comprende poner en contacto una muestra de ensayo que comprende una célula diferenciada in vitro con una sustancia de ensayo que se va a cribar, en el que en dicha célula se induce la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula, tejido u órgano enfermos; y determinar un cambio sensible del fenotipo en dicha muestra de ensayo, 25 en el que un cambio sensible que evite o retrase el inicio o la progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de un fármaco útil y si potencia el inicio o progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de la toxicidad del compuesto.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para cribar una sustancia respecto a la capacidad de mejorar una cardiomiopatía que comprende 30 poner en contacto una muestra de ensayo que comprende un cardiomiocito diferenciado in vitro con una sustancia de ensayo antes, durante o después de que en dicha célula se induzca la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula, tejido u órgano enfermos; medir

un parámetro cardiomiopático en el cardiomiocito; y comparar la medición así obtenida con la de un cardiomiocito no sometido a la sustancia; en el que la medición del parámetro del cardiomiocito en los cardiomiocitos es coherente con una reducción en la hipertrofia cardiaca.

La presente invención también se refiere a un kit o composición útiles para 5 realizar el ensayo basado en células diferenciadas in vitro de la presente invención, que contiene una célula...

1. Un procedimiento para identificar y/u obtener un fármaco para la mejora o tratamiento de una cardiopatía o para determinar la toxicidad de un compuesto que comprende: 5

(a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende una célula diferenciada in vitro con una sustancia de ensayo que se va a cribar, en el que en dicha célula se induce la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula de una célula, tejido u órgano enfermos; y 10

(b) determinar un cambio sensible del fenotipo en dicha muestra de ensayo, en el que un cambio sensible

(i) que evite o retrase el inicio o la progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de un fármaco útil; y

(ii) si potencia el inicio o progresión del fenotipo de enfermedad es 15 indicativo de la toxicidad del compuesto;

en el que dicha célula diferenciada in vitro es un cardiomiocito y dicho fenotipo es un fenotipo hipertrófico cardiaco.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichas células diferenciadas in vitro proceden de células pluri o multipotentes. 20

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dichas células pluri o multipotentes proceden de ratón o de rata.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichas células pluri o multipotentes son embriocitos indiferenciados (células ES).

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que 25 dicha célula diferenciada in vitro comprende un gen marcador seleccionable unido de manera operable con una secuencia reguladora específica de un tipo de célula y un gen indicador unido de manera operable con una secuencia reguladora específica de un tipo de célula.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho marcador 30 seleccionable confiere resistencia a la puromicina y/o dicho indicador se selecciona de diferentes versiones coloreadas de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP).

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicha secuencia reguladora específica de un tipo de célula del gen indicador es básicamente la misma

que dicha secuencia reguladora específica de un tipo de célula del gen marcador.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha secuencia reguladora específica de un tipo de célula es auriculo y/o ventrículo-específica. 5

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho promotor es una secuencia reguladora cardio-específica que se selecciona de promotores de αMHC, MLC2v, MLC1a, MLC2a y βMHC.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha célula diferenciada in vitro está presente en un cuerpo embrioide (EB). 10

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha cardiopatía es insuficiencia cardiaca o una cardiomiopatía.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho fenotipo incluye un parámetro seleccionado del grupo constituido por tamaño celular, forma celular, síntesis proteica, organización de filamento de 15 actina/miosina, activación del patrón de expresión génica característico de células cardiomiopáticas y/o activación de genes que se expresan durante el desarrollo embrionario temprano.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho fenotipo se induce mediante el cultivo de dicha célula diferenciada in vitro 20 en presencia de un compuesto fisiológicamente activo.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dicho compuesto es un agonista hipertrófico, preferiblemente seleccionado del grupo constituido por endotelina-1, angiotensina II o un agonista α1-adrenérgico, preferiblemente fenilefrina.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el 25 que dicha célula diferenciada in vitro se modifica mediante ingeniería genética para mostrar dicho fenotipo.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha célula diferenciada in vitro se modifica mediante ingeniería genética para expresar o suprimir un gen que codifica una potencial diana de un fármaco. 30

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende medir la actividad eléctrica a través de una matriz de electrodos y, opcionalmente, parámetros adicionales.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el

que se analizan uno cualquiera o todos de los parámetros siguientes:

(i) canales de Na+;

(ii) canales de Ca2+/K+;

(iii) canales de K+;

(iv) amplitud y/o duración del potencial de campo (FDP); 5

(v) cronotropismo de células cardiacas o periodos de ráfagas de células neuronales;

(vi) Arritmias, fenómenos tipo EAD;

(vii) valor de pH;

(viii) presión parcial de oxígeno (pO2); 10

(ix) detención del latido; y

(x) análisis de contractibilidad con disociación AV, SIN efectos y/o cambios morfológicos.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicha célula diferenciada in vitro está presente en cuerpos embrioides (EB) 15 diferenciados en cardiomiocitos.

20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que los EB comprenden tejido cardiaco funcional que late de forma autónoma y abarca las propiedades electrofisiológicas de cardiomiocitos auriculares y ventriculares, así como de células marcapaso. 20

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha célula diferenciada in vitro procede de una línea de células ES de murino.

22. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 para cribar una sustancia respecto a la capacidad de mejorar una cardiomiopatía que 25 comprende:

(a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende un cardiomiocito diferenciado in vitro con una sustancia de ensayo antes, durante o después de que en dicha célula se induzca la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula de una célula, 30 tejido u órgano enfermos;

(b) medir un parámetro cardiomiopático en el cardiomiocito de la etapa (a);

(c) comparar la medición obtenida en la etapa (b) con la de un cardiomiocito no sometido a la sustancia;

en el que la medición del parámetro del cardiomiocito en los cardiomiocitos de la etapa (a) es coherente con una reducción de la hipertrofia cardiaca.

23. El procedimiento según la reivindicación 22, en el que el parámetro cardiomiopático es la expresión de un gen o actividad de un producto génico 5 seleccionado del grupo constituido por un gen del factor natriurético auricular, un gen del péptido natriurético de tipo b, un gen de cadena pesada de β-miosina, un gen de actina α-esquelética, c-FOS, c-JUN, c-MYC, genes de repuesta a crecimiento temprano, proteína 70 de choque térmico, cadena pesada de alfa-miosina, colágeno III, preproendotelina-1, cadena 2 ligera de miosina, intercambiador de Na+/H+, alfa-actina 10 cardiaca, intercambiador de Na+/Ca2+, receptor de fosfatidilinositol-3, enzima conversora de angiotensina, colágeno I, colágeno XV, Ca-ATPasa-2 alfa del retículo sarcoplasmático, beta-adrenorreceptor, proteína cinasa C y fosfolamban.

24. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el 15 que dicha etapa de puesta en contacto incluye adicionalmente poner en contacto dicha muestra de ensayo con al menos una segunda sustancia de ensayo en presencia de dicha primera sustancia de ensayo.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el 20 que un compuesto que se sabe que activa o inhibe el proceso de diferenciación y/o la formación de estructura tisular se añade al medio de cultivo.

26. Uso de un kit o composición para llevar a cabo un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que contiene una célula multi o pluripotente, 25 una célula diferenciada in vitro, medio de cultivo, moléculas de ácido nucleico recombinante y/o compuestos estándar.

27. Uso de un equipo en el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para analizar un parámetro del fenotipo. 30

28. Uso de una célula diferenciada in vitro en la que se induce la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido según un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 en la validación de una diana, descubrimiento de un

fármaco u obtención de un perfil farmacocinético o farmacológico.

29. Un procedimiento de identificación y/o obtención de un gen o producto génico implicado en una enfermedad como la diana de un fármaco que comprende obtener el perfil de la expresión de una célula diferenciada in vitro como se define en 5 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 antes y después de la inducción de dicho fenotipo, en el que la expresión diferencial de un gen o producto génico es indicativa de una potencial diana de un fármaco.

30. El procedimiento de la reivindicación 29, que comprende además clonar el 10 gen identificado o un ADNc correspondiente o fragmento del mismo.

31. Un procedimiento de validación de una potencial diana de un fármaco que comprende

(a) modificar la expresión de un gen diana y/o actividad del producto 15 génico diana en una célula diferenciada in vitro como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 antes, durante o después de que en dicha célula se induzca la expresión de un fenotipo de enfermedad predefinido que básicamente corresponde a un fenotipo de una célula de una célula, tejido u órgano enfermos; y

(b) determinar un cambio sensible del fenotipo de dicha célula, en el que 20 un cambio sensible

(i) que evite o retrase el inicio o la progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de que se activará una diana de un fármaco; y

(ii) si potencia el inicio o progresión del fenotipo de enfermedad es indicativo de que se inhibirá una diana de un fármaco para el tratamiento de la 25 enfermedad.