COMPOSICIONES PARA LA DERIVACIÓN CULTIVO IN VITRO DE LÍNEAS DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS (ES) CON CAPACIDAD DE TRANSMISIÓN DE LA LÍNEA GERMINAL Y PARA EL CULTIVO DE CÉLULAS MADRE ADULTAS.

Un método para obtener, mantener o hacer crecer células madre embrionarias pluripotentes de roedor que comprenden la etapa de cultivar las células durante al menos un pase en una composición que comprende un medio de cultivo celular básico condicionado,

en donde dicho medio está condicionado por la línea celular de fibroblastos Rab9 de conejo y contiene menos de 0,1 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF)

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/BE2002/000196.

Solicitante: THROMBOGENICS N.V..

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: HERESTRAAT 49 3000 LEUVEN BELGICA.

Inventor/es: SCHOONJANS,Luc.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 20 de Diciembre de 2002.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01K67/027M
  • C07K14/54E
  • C12N5/06B11P
  • C12N5/06B2P

Clasificación PCT:

  • A01K67/027 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRÍA DE ANIMALES; AVICULTURA; APICULTURA; PISCICULTURA; PESCA; ANIMALES PARA CRIA O REPRODUCCIÓN, NO PREVISTOS EN OTRO LUGAR; NUEVAS VARIEDADES DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • C07K14/54 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Interleuquinas (IL).

Clasificación antigua:

  • A01K67/027 A01K 67/00 […] › Nuevas razas de vertebrados.
  • C07K14/54 C07K 14/00 […] › Interleuquinas (IL).
  • C12N5/06

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2362353_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la obtención, el mantenimiento y el crecimiento de células madre embrionarias (ES) pluripotentes y competentes para la línea germinal. La presente invención también se refiere a la obtención, el mantenimiento y el crecimiento de células madre adultas (ASC).

Antecedentes de la invención

Células madre embrionarias

Las líneas de células ES son líneas celulares aisladas a partir del embrioblasto (del inglés, “inner cell mass” ICM) de embriones en la etapa de blastocisto, que bajo condiciones específicas, se pueden mantener en cultivo durante muchos pases, es decir, extendiendo de nuevo las células sobre nuevas placas de cultivo celular a intervalos de tiempo regulares, sin pérdida de su pluripotencia. Mantienen un cariotipo normal y cuando se reintroducen en un blastocisto hospedador, pueden colonizar la línea germinal. Tales líneas celulares pueden proporcionar una profusión de células pluripotentes a que se pueden transformar in vitro con ADN (véase más abajo), y seleccionar para recombinar (de forma homóloga o no homóloga) el ADN exógeno con el ADN cromosómico, permitiendo la incorporación estable del gen deseado. Sin embargo, hasta la fecha, la transmisión de la línea germinal, es decir, la transmisión del genoma de ES a la siguiente generación, solo se ha conseguido con células ES de ciertas cepas de ratón.

Las células madre embrionarias de múrido se aislaron por primera vez en 1981. Desde entonces, se han establecido distintas líneas celulares de ES y ahora se emplean de forma extensa y con éxito para la introducción de mutaciones dirigidas u otras alteraciones genéticas, en el genoma de ratón. La mayoría de las líneas celulares ES de ratón competentes para la línea germinal, que están actualmente en uso, se han obtenido en la cepa 129, y el resto en otras pocas cepas endogámicas (C57BL/6 y cruces con C57BL/6). Además, las líneas celulares ES se obtienen con éxito en 30% de los blastocistos explantados, incluso en la cepa 129, y el índice de éxito de alrededor del 10% parece que se aproxima a la norma.

La vía de uso más empleada generalmente para generar animales quiméricos es inyectar aproximadamente 10-15 células ES aisladas en el blastocele de un blastocisto hospedador y permitir que las células se mezclen con las células del embrioblasto. Los blastocistos quiméricos resultantes se transfieren a continuación a receptores para multiplicarse. Alternativamente, la agregación diploide usando embriones en una etapa muy precoz (8-16 células) y la agregación tetraploide, se pueden utilizar como hospedadores para las células ES. Brevemente, las células ES se intercalan entre embriones en fase temprana, desprovistos de su zona pelúcida, se cultivan durante una noche y se implantan en una madre adoptiva. Esta técnica se puede realizar bajo condiciones con las que se obtiene una descendencia quimérica o totalmente derivada de células ES.

Aunque el cultivo de células ES y la producción de quimeras se ha mejorado técnicamente a lo largo de los años, la pluripotencia de las células ES se reduce todavía frecuentemente después de varios pases, mientras que fetos obtenidos completamente a partir de células ES (mediante agregación tetraploide) parece que tienen una supervivencia bastante reducida después del nacimiento. Nagy y otros, “Derivation of completely cell cultura derived mice from early-passage embryonic stem cells”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 8424-8, usaron líneas celulares ES R1, obtenidas a partir de embriones tetraploides obtenidos a partir de pases tempranos con electrofusión, para formar agregados y obtuvieron ratones que se habían producido totalmente a partir de células ES. Sin embargo, las células ES RI perdieron su totipotencia después de extenderlas en un cultivo in vitro, porque ningún animal procedente de células ES obtenidas a partir de más de 14 pases, sobrevive hasta la edad adulta. Por otra parte, incluso cuando se utilizaron células de pases tempranos, muchos de los agregados tetraploides de ES murieron antes de desarrollarse totalmente. Solamente 3,8% de los agregados transferidos sobrevivieron después de la cesárea. El objetivo de obtener ratones ES viables usando células ES de pases posteriores, no se alcanzó y la producción de ratones obtenidos a partir de células ES usando células ES modificadas genéticamente, parecía no ser posible.

La incapacidad de la presente tecnología para obtener una descendencia viable a partir de células ES de cepas endogámicas de ratón, a través de la agregación tetraploide, se confirmó recientemente en Eggan K, y otros, “Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation”. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001; 98: 6209-14. Se observó que la heterocigosidad genética es un parámetro crucial que influye en la supervivencia postnatal de la descendencia obtenida a partir de células ES, mediante clonación nuclear

o complementación de embriones tetraploides. Crías obtenidas a partir de células ES endogámicas a través de cualquier otro método, morían perinatalmente con un fenotipo de fallo respiratorio. En cambio, la gran mayoría (80-85%) de las crías obtenidas a partir de células ES F1, a través de cualquier procedimiento, sobrevivían hasta la edad adulta. En otro estudio, sin embargo, no se encontró una correlación clara entre la mortalidad postnatal de ratones obtenidos a partir de células ES y la línea celular utilizada. La muerte postnatal tenía lugar en todas las líneas celulares, incluyendo las que tenían una información genética diferente. Treinta cuatro recién nacidos obtenidos totalmente a partir de células ES (3%), se obtuvieron después de transferir 1037 blastocistos tetraploides inyectados con ES, procedentes de todas las líneas celulares. Solamente trece ratones (1%) crecieron hasta la edad adulta (Amano T, Kato Y, Tsunoda Y. “Comparison of heat-treated and tetraploid blastocysts for the production of completely ES-cellderived mice”. Zygote 2001; 9: 153-7).

Se han aislado células ES presuntamente pluripotentes a partir de una variedad de otras especies distintas a los ratones, que incluyen hámster, cerdo, oveja, vaca, visón, rata, primate, ser humano, pollo, tití, medaka y hombre. Solamente en pocos casos (cerdo, pollo, medaka), estas líneas celulares han dado lugar a quimeras cuando se reintrodujeron en blastocistos, pero hasta el momento, ninguna ha ocasionado una transmisión de la línea germinal.

El aislamiento de líneas celulares ES pluripotentes a partir de blastocistos de conejo preimplantados, ha sido descrito por Graves KH, Moreadith RW, “Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos”, Mol Reprod. Dev.; 36: 424-33. Se observó que estas líneas ES producían tipos celulares diferenciados, representativos de las tres capas germinales (pluripotentes, según los criterios in vitro). Recientemente, se observó que estas líneas ES procedentes de la cepa Dutch Belted, eran también capaces de generar quimeras evidentes del color del pelaje, después de la inyección en blastocistos receptores de New Zealand White, demostrando que las células eran también pluripotentes según los criterios in vivo. Sin embargo, no se ha conseguido la transmisión de la línea germinal. Experimentos adicionales mostraron que la baja frecuencia de formación de quimeras y la ausencia de transmisión de la línea germinal, se debía probablemente a la pérdida de pluripotencia de la línea celular ES, después de un número elevado de pases.

Las células ES se mantienen en un estado indiferenciado por la presencia de capas nutricias que producen varios factores que impiden que las células se diferencien. Se ha observado que diversas citocinas son responsables de este efecto: DIA/LIF (actividad inhibidora de la diferenciación/factor inhibidor de la leucemia), interleucina-6 junto con el receptor soluble de la interleucina-6, interleucina-11, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar y cardiotrofina. Ahora es posible establecer y mantener células ES en cultivo, en ausencia de células nutricias, pero en presencia de tales factores, por lo menos durante varios pases. En especies distintas al ratón, la tecnología de células ES está todavía poco desarrollada y no hay datos publicados que indiquen la transmisión de la línea germinal en cualquier especie con excepción del ratón.

El factor inhibidor de la leucemia recombinante (LIF)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para obtener, mantener o hacer crecer células madre embrionarias pluripotentes de roedor que comprenden la etapa de cultivar las células durante al menos un pase en una composición que comprende un medio de cultivo celular básico condicionado, en donde dicho medio está condicionado por la línea celular de fibroblastos Rab9 de conejo y contiene menos de 0,1 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende mantener o hacer crecer las células madre embrionarias pluripotentes durante al menos 10 pases en forma de células indiferenciadas.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dichas células madre embrionarias pluripotentes de roedor son células madre embrionarias competentes para la línea germinal.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el roedor es Rattus sp.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el roedor es Mus sp.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el roedor es un ratón con una información genética seleccionada entre el grupo consistente en 129/SvEv, C57BL/6N, C57BL/6J-HPRT, BALB/cAnN, CBA/CaOla, 129/SvJ, DBA/2N, DBA/1OIa, C3H/HeN, C57BL/6JOla, FVB/N y Swiss Webster.

7. Un método para generar roedores transgénicos a partir de células madre embrionarias de roedor, que comprende la etapa de cultivar las células madre embrionarias de roedor durante al menos un pase en una composición que comprende un medio de cultivo celular básico condicionado, en donde dicho medio está condicionado por la línea celular de fibroblastos Rab9 de conejo y contiene menos de 0,1 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF).

8. Uso de una composición que comprende un medio de cultivo celular básico condicionado en donde dicho medio está condicionado por la línea celular de fibroblastos Rab9 de conejo y contiene menos de 0,1 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF) para obtener, mantener y hacer crecer células madre embrionarias pluripotentes de roedor.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dichas células madre embrionarias pluripotentes de roedor son células madre embrionarias competentes para la línea germinal.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde el roedor es Rattus sp.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde el roedor es Mus sp.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el roedor es una cepa de ratón Mus musculus de cualquiera de las cepas con una información genética seleccionada entre el grupo consistente en 129/SvEv, C57BL/6N, C57BL/6J-HPRT, BALB/cAnN, CBA/CaOla, 129/SvJ, DBA/2N, DBA/1OIa, C3H/HeN, C57BL/6JOla, FVB/N y Swiss Webster.

13. Uso de una composición que comprende un medio de cultivo celular básico condicionado, en donde dicho medio está condicionado por la línea celular de fibroblastos Rab9 de conejo y contiene menos de 0,1 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF), para la expansión de células madre adultas de mamífero aisladas o células progenitoras tempranas adultas.

14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde las células madre adultas son células madre hematopoyéticas y las células progenitoras tempranas adultas son células precursoras hematopoyéticas.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las células madre hematopoyéticas aisladas o las células precursoras hematopoyéticas son células CD 34+ humanas.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en donde las células madre hematopoyéticas o las células precursoras hematopoyéticas se aíslan a partir de una fuente seleccionada entre el cordón umbilical, la sangre de la placenta, la sangre periférica y la médula ósea.

17. Un método para expandir células madre adultas de mamífero o células progenitoras tempranas adultas que comprende la etapa de cultivar las células durante al menos un pase en una composición que comprende un medio de cultivo celular básico condicionado, en donde dicho medio está condicionado por la línea celular de fibroblastos Rab9 de conejo y contiene menos de 0,1 ng/ml de factor inhibidor de la leucemia (LIF).

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde las células madre adultas de mamífero son células madre hematopoyéticas y las células progenitoras tempranas adultas son células precursoras hematopoyéticas.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende la etapa de cultivar las células madre adultas de mamífero o las células progenitoras tempranas adultas hasta que se obtiene una expansión de al menos 25 veces.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 17, que comprende la etapa de cultivar las células madre adultas de mamífero o las células progenitoras tempranas adultas hasta que la cantidad de células con núcleo se expande al menos 10 veces.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde en la población de células madre adultas de 5 mamífero o de células progenitoras tempranas adultas, la cantidad de células CD34+ se expande al menos 3 veces.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la población de células madre adultas de mamífero o de células progenitoras tempranas adultas se cultiva durante al menos 15 días.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el número de células madre adultas de mamífero o de células progenitoras tempranas adultas expandidas que responden positivamente en un ensayo LTC IC, se in10 crementa al menos 15 veces.

24. El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde dicho medio comprende adicionalmente suero fetal, de recién nacido o de adulto.

25. El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde dicho medio comprende adicionalmente beta-mercaptoetanol o ditiotreitol. 26. El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde dicho medio comprende adicionalmente aminoácidos no esenciales.

27. El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde dicho medio comprende adicionalmente glutamina.

28. El método o el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en donde dicho medio 20 está suplementado con uno o varios compuestos seleccionados entre el grupo consistente en interleucina, oncostatina, factor neurotrófico ciliar, factor de células madre, factor básico de crecimiento de fibroblastos y cardiotrofina.


 

Patentes similares o relacionadas:

MODELOS DE SELECCIÓN IN VIVO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y OTROS TRASTORNOS RELACIONADOS CON QPCT, del 17 de Enero de 2012, de PROBIODRUG AG: Animal transgénico no humano que sobreexpresa glutaminil ciclasa que comprende células que contienen un transgén de ADN que codifica para glutaminil ciclasa.

ANIMAL TRANSGÉNICO IL-18, del 13 de Enero de 2012, de Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Nakanishi, Kenji Mizutani, Hitoshi: Un ratón transgénico que secreta de forma continua IL-18 madura en sangre y que desarrolla de forma continua dermatitis atópica, que comprende un ADN en el que una secuencia […]

COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE TRASTORNOS INMUNITARIOS, del 15 de Diciembre de 2011, de MILLENNIUM PHARMACEUTICALS, INC.: Un anticuerpo que se une específicamente a un péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID N.º: 2 o un péptido codificado por el gen […]

MODELO TRANSGÉNICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, del 2 de Noviembre de 2011, de BioArctic Neuroscience AB: Un ratón transgénico que expresa un transgén que comprende una secuencia de ADN que codifica una Proteína Precursora Amiloide (APP) heteróloga que comprende la mutación […]

CONSTRUCCION GENICA QUE COMPRENDE EL GEN QUE CODIFICA LA PROTEINA KAPY ANIMAL NO HUMANO MODIFICADO GENETICAMENTE CON LA MISMA, del 30 de Junio de 2011, de FUNDACIO INSTITUT DE RECERCA HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HEBRON, FUNDACIO PRIVADA: La presente invención se refiere a una construcción génica que comprende el gen de la proteína renal regulada por andrógenos (KAP) de ratón bajo el control […]

MEDIO DE CULTIVO DE CÉLULAS EMBRIONARIAS TOTIPOTENTES AVIARES, del 7 de Junio de 2011, de INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON: Procedimiento de cultivo de células embrionarias totipotentes aviares (o células ES aviares), caracterizado porque: 1) Se suspenden unas células que proceden de discos […]

Imagen de 'CÉLULAS ES MODIFICADAS Y GEN ESPECÍFICO DE CÉLULAS ES'CÉLULAS ES MODIFICADAS Y GEN ESPECÍFICO DE CÉLULAS ES, del 13 de Mayo de 2011, de INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) ECOLE NORMALE SUPERIEURE DE LYON: Ácido nucleico purificado o aislado, caracterizado porque comprende una secuencia nucleica seleccionada de entre el grupo de secuencias siguientes: a) SEC ID […]

MEDIO DE CULTIVO CELULAR Y PROCEDIMIENTO DE CULTIVO DE CÉLULAS MADRE Y CÉLULAS PROGENITOR, del 15 de Febrero de 2011, de UNIVERSITÄT LEIPZIG: Utilización de un medio de cultivo celular que contiene menos de 500 mg/l de glucosa y menos de 500 µg/l de inositol, que comprende un medio basal suministrado como una solución […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .