Un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es:

5'-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3' (SEC ID Nº: 1). en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las letras minúsculas designan un 2-desoxinucleótido, el subíndice "s" designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de HIF1-a. En particular, esta invención se refiere a oligonucleótidos de LNA que pueden hibridar específicamente con ácidos nucleicos que codifican HIF-1a. Se ha mostrado que los oligonucleótidos de LNA modulan la expresión de HIF-1a, y se desvelan preparaciones farmacéuticas de los mismos y su uso como tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades inflamatorias y enfermedades oculares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los tumores sólidos tienen que establecer un suministro de sangre y tienen un metabolismo de glucosa aumentado para crecer más allá de unos pocos milímetros. Cómo detectan la hipoxia y responden mediante la activación de genes inducibles por hipoxia y la secreción de factores angiogénicos para establecer un sistema sanguíneo es fundamental para la biología del cáncer. Muchos tumores contienen microentornos hipóxicos, que se han asociado con progresión maligna, metástasis y resistencia a radioterapia y quimioterapia.

El descubrimiento del factor-1 inducible por hipoxia (HIF-1) proporcionó nuevas percepciones de la regulación de genes inducibles por hipoxia (documentos US 5.882.914 y WO 96/39426; WO 99/48916). HIF-1 se compone de dos subunidades HIF-1a (HIF-1alfa; denominada en el presente documento “HIF-1a o HIF-1α”) y HIF-1β y se une a elementos de respuesta a hipoxia-1 (HRE) en potenciadores de genes que codifican factores angiogénicos tales como VEGF y proteínas relacionadas con la glicolisis tales como enzimas glicolíticas y el transportador de glucosa 1 y 3 (GLU-1 y 3).

Se ha demostrado que la regulación negativa obtenida por ingeniería genética de HIF1a por transferencia de genes intratumorales de un plásmido de HIF-1a antisentido conduce a la regulación negativa de VEGA y a la reducción de la densidad de microvasos en el tumor (documento WO 00/76497, Sun X y col, Gene Therapy (2001) 8, 638-645). El plásmido contenía un fragmento de ADNc de 320 pb que codificaba el extremo 5' de HIF-1a (nucleótidos 152-454; Genebank AF003698).

El documento WO 2003/085110 muestra oligonucleótidos antisentido de LNA que regulan negativamente la expresión de HIF-1a humano. Un compuesto se denomina CUR813 (SEC D Nº: 11).

La presente invención desvela un oligonucleótido de LNA, que es más potente que CUR813 (SEC ID Nº: 11). Además, los oligonucleótidos de LNA específicos de acuerdo con la invención inducen la apoptosis e inhiben la proliferación. Además, los oligonucleótidos de LNA que tienen una identidad de secuencia del 100% con HIF-1a de ratón regulan negativamente la expresión de HIF-1a en el hígado, colon y riñón en ratones. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para modular la expresión de HIF-1a. El oligonucleótido de LNA de la invención es un potente inhibidor de la expresión de ARNm de HIF-1α y de los niveles de la proteína.

Más particularmente, la presente invención proporciona un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es 5'-TsGsGscsasgscsastscscsTsGsTsa-3' (SEC ID Nº: 1). en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las letras minúsculas indican un 2-desoxinucleótido, y el subíndice “s” indica un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el oligonucleótido de LNA de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1A muestra una mayor estabilidad de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 5 en plasma de rata (NtacSD macho, Li-Heparine (Taconic, M&B)) en comparación con la SEC ID

N: 6. Los oligonucleótidos se incubaron a concentraciones 20 µM a 37ºC durante 0, 4 ó 24 horas. No pueden detectarse fragmentos de degradación de la SEC ID Nº: 1 incluso después de 24 horas de digestión.

La Figura 1B muestra la Estabilidad de la SEC ID Nº: 1 de Longitud Completa y la SEC ID Nº: 13, un fosforotioato e isosecuencial a la SEC ID Nº: 1, en suero de rata y humano. Se añadieron oligonucleótidos a suero humano o de rata a una concentración final de 20 µM. La figura muestra la estabilidad del oligonucleótido de LNA hasta 1-96 horas en suero humano y de rata respectivamente a 37ºC. Para el suero de rata, el penúltimo panel en la Figura 1B demuestra una actividad enzimática sostenida incluso después de 48 horas y 96 horas. El último panel funciona como control negativo que demuestra la ausencia de degradación de la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 13 cuando se incuban a 37ºC sin añadir plasma.

La Figura 1C muestra una estabilidad extremadamente prolongada de la SEC ID Nº: 1 en plasma humano y de rata. El oligonucleótido se incubó en plasma humano o de rata durante 1-96 horas y se procesó en un gel de desnaturalización. Después de teñir con SyBr Gold, se midió la cantidad de producto de longitud completa usando un Phosphorimager y se representó frente al tiempo.

La Figura 2A muestra la regulación negativa de la proteína HIF-1a en células U373 transfectadas con oligonucleótidos de LNA. Se transfectaron células U373 con compuesto 2 ó 10 nM o se transfectaron de forma simulada, se incubaron en condiciones de hipoxia y se analizaron con respecto a la regulación negativa de la proteína HIF-1a por transferencia de

Western. La expresión de tubulina se analizó como control de carga igual.

La Figura 2B muestra la regulación negativa de la proteína HIF-1alfa después del tratamiento con la SEC ID Nº: 1 en líneas de células cancerosas de glioblastoma U373. La expresión de pan-actina se analizó como control de carga igual. Se transfectaron células con concentraciones 0,2, 1 y 10 nM de SEC ID Nº: 1 o SEC ID Nº: 10, que es un mm 2 bp con respecto a la SEC ID Nº: 1. El panel inferior es una cuantificación del gel.

La Figura 2C muestra la regulación negativa de la expresión de HIF-1a 24 horas después del tratamiento con el oligonucleótido de LNA que se dirige a HIF-1a, SEC ID Nº: 1, y un LNA que contiene oligonucleótidos de control mezclados de la SEC ID Nº: 8 en células U373. La expresión de HIF se correlaciona con GAPDH o Beta-actina y se relaciona con un control no transfectado (simulado). Después de la purificación del ARN, se cuantifica la expresión de ARNm por QPCR.

Las Figuras 3A y 3B muestran la inducción de apoptosis medida como un perfil cinético de la actividad de la Caspasa 3/7 inducida después de un tratamiento de 24-72 horas con oligonucleótidos de LNA en la línea celular de glioblastoma U373 en condiciones de normoxia o hipoxia. Se muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inductor de una apoptosis temprana.

Figura 4A: Inducción de fase celular apoptótica temprana medida por análisis de citometría del flujo con PI y Anexina V-FITC después de 48 horas. Las células U373 tratadas con el oligonucleótido de LNA de la SEC ID Nº: 1 se clasificaron como más “apoptóticas tempranas” en comparación con las células tratadas de forma simulada y tratadas con la SEC ID Nº: 12.

Figura 4B: Cuantificación de la inducción de la apoptosis temprana en células U373 después del tratamiento con la SEC ID Nº: 1. Porcentaje de células forzadas a entrar en apoptosis temprana 48 horas después del tratamiento de la SEC ID Nº: 1 en diferentes dosificaciones. Se transfectaron células U373 con la SEC ID Nº: 1 o dos oligonucleótidos de control mezclados diferentes de la SEC ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 12. Después de la recolección e incubación con ab de Anexina V y PI, se midió el número de células con apoptosis temprana por citometría de flujo.

Las Figuras 5A y 5B muestran células de la línea celular de glioblastoma U373 transfectadas con compuestos 24-72 horas después de la transfección e incubación en condiciones de hipoxia o normoxia. Se muestra que la SEC ID Nº: 1 es un potente inhibidor de la proliferación como se mide por ensayo MTS.

La Figura 6A y la Figura 6B muestran la regulación negativa de la diana en hígado endógena in vivo de dos regímenes de administración usando la SEC ID Nº: 1. La medición de los niveles de ARNm de HIF-1α así como el VEGF diana aguas abajo muestra que la SEC ID Nº: 1 también es un inhibidor eficaz de dicha diana. Figura 6A: inyecciones ip diariamente en ratones con pelo durante 14 días....

1. Un oligonucleótido de LNA que consiste en una secuencia que es: 5'-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3' (SEC ID Nº: 1). en la que las letras mayúsculas indican un análogo de beta-D-oxi-nucleótido de LNA, las

letras minúsculas designan un 2-desoxinucleótido, el subíndice “s” designa un enlace fosforotioato entre nucleótidos/análogos de nucleótidos de LNA vecinos.

2. Un conjugado que comprende un oligonucleótido de LNA de acuerdo con la reivindicación 1 y al menos un resto no nucleotídico o no polinucleotídico unido covalentemente a dicho oligonucleótido de LNA.

3. Una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2, y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende un vehículo acuoso, comprendiendo dicho vehículo un tampón para mantener el pH en el intervalo de 4,0-8,5 y que tiene una intensidad iónica de 20-2000 mM.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, que está adaptada para administración intraocular.

6. La composición farmacéutica de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende además al menos un agente quimioterapéutico.

7. El oligonucleótido de LNA como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2 para uso como un medicamento.

8. Uso del oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicho cáncer está en forma de un tumor sólido.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en hepatoma y cáncer de cabeza y cuello, mieloma múltiple, cáncer renal, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer cerebral y cáncer de mama.

5 11. Uso de un oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación 1 o un conjugado como se define en la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en arteriosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, asma, enfermedad inflamatoria del intestino, verrugas, dermatitis alérgica, inflamación e inflamación cutánea.

10

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la enfermedad se selecciona entre enfermedad inflamatoria del intestino, psoriasis y artritis reumatoide.

13. Un kit que comprende

15 (a) un primer componente que contiene un oligonucleótido de LNA como se define en la reivindicación o un conjugado como se define en la reivindicación 2 en forma sólida, y

(b) un segundo componente que contiene solución salina o tampón adaptada para la reconstitución de dichos oligonucleótidos de LNA.

20