Análogos de ARN pequeños de interferencia (ARNpi).

Un compuesto bicatenario que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante,

en el que cada hebra comprende 12-35 nucleótidos y en el que dicho compuesto comprende al menos un monómero de ácido nucleico cerrado (LNA) que tiene la estructura **(Ver fórmula)** en las que X se selecciona a partir del grupo constituido por O, S y NR H , donde R H es H o alquilo C 1-4; Y es CH2; B es una nucleobase; Z y Z* están independientemente ausentes o se seleccionan a partir del grupo constituido por un grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; de forma que cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 3'', Z es un grupo terminal y Z* es un grupo de enlace internucleosídico; cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 5'', Z está ausente y Z* es un grupo terminal; y cuando el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace internucleosídico, y en el que ningún monómero de LNA está localizado en el extremo 5'' de la hebra no codificante.

Análogos de ARN pequeños de interferencia (ARNpi)

Campo de la invención La presente invención se refiere a análogos pequeños de interferencia (ARNpi) bicatenarios novedosos que comprenden monómeros de ácidos nucleicos cerrados (LNA) . Dichos compuestos inducen la silenciación génica postranscripcional específica de secuencia en muchos organismos mediante un procedimiento conocido comointerferencia de ARN (iARN) . Los compuestos descritos en el presente documento tienen propiedades mejoradas con respecto a los ARNpi no modificados y pueden, en consecuencia, resultar útiles como agentes terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de diversas formas de cáncer.

Antecedentes de la invención Fire y cols. descubrieron la interferencia de ARN (iARN) en C. elegans (Nature, 1998, 391, 806-811) . Se encontró que largos tramos de ARN bicatenario (ARNds) poseían un potente poder inactivador en la expresión génica que podía mantenerse durante generaciones en el gusano. La interferencia de ARN (iARN) rápidamente se convirtió en una herramienta genómica funcional en C. elegans (los inicios de la interferencia de ARN se revisan por Fire (TIG, 1999, 15, 358-363) y Bosher y Labouesse (Nature Cell Biology, 2000, 2, E31-E36) ) . Los primeros estudios en los que se demostró que la interferencia de ARN funcionaba en los vertebrados se realizaron en embriones de Danio rerio y en oocitos de ratón (Wargelius y cols., Biochem. Biophys. Res. Com. 1999, 263, 156-161, Wianny y Zernicka-Goetz, Nature Cell Biology, 2000, 2, 70-75) . Dado que el ARNds induce efectos no específicos en las células demamífero, se ha planteado la hipótesis de que estos mecanismos no estaban completamente desarrollados en elsistema embrionario murino (Alexopoulou y cols., Nature, 2001, 413, 732-738, Reviews: Stark y cols., Annu. Rev. Biochem., 1998, 67, 227-264 y Samuel, Clin. Micro. Rev., 2001, 14, 778-809) .

En lo que respecta a C. elegans y Drosophila, se ha demostrado que las hebras largas de iARN se degradan ahebras bicatenarias cortas (21-23 nucleótidos) y que estas formas degradadas actúan de mediadoras de la interferencia (Zamore y cols., Cell, 2000, 101, 25-33 y Elbashir y cols., Gen. Dev., 2001, 15, 188-200) . Elbashir ycols. (Gen. Dev., 2001, 15, 188-200) demostraron que la escisión es igual en una diana codificante o no codificante y que ambas hebras del ARNpi pueden guiar la escisión contra el ARN no codificante o codificante, respectivamente. Elbashir y cols. mostraron de forma concluyente (Nature, 2001, 411, 494-498) que los ARNpi actúan de mediadores de una inactivación potente en una diversidad de líneas celulares de mamífero y probablemente eludían los efectos no específicos adversos de los ARNds largos en las células de mamífero. Este descubrimiento supuso un hito en la biología moderna y la aplicación de los ARNpi como agentes terapéuticos se convirtió rápidamente en un campo atractivo de investigación (revisado por McManus y Sharp, Nature Reviews Genetics, 2002, 3, 737-747 y Thompson, DDT, 2002, 7, 912-917) .

Los ARNds son bastante estables en medios biológicos. Sin embargo, en el momento en el que el dúplex se disocia formando las hebras individuales, estas, al ser de ARN, se degradan inmediatamente. Una de las estrategias para conferir mayor estabilidad al ARNpi ha sido introducir restos de ARN químicamente modificados en las hebras individuales del ARNpi. Es bien sabido que los análogos de ARN sintéticos son mucho más estables en medios biológicos y que también se induce una estabilidad incrementada en los residuos de ARN naturales próximos. Por mayor estabilidad lo que se quiere decir principalmente es una mayor resistencia a las nucleasas pero también condichas modificaciones se puede conferir una mejor captación celular y distribución tisular. Se han descrito diversos análogos de ARNsi:

Pre-ARNsi (Parrish y cols. Mol. Cell, 2000, 6, 1077-1087) muestran tolerancia a ciertas modificaciones en laestructura para la iARN en C. elegans. Mediante la transcripción in vitro de las dos hebras diferentes en presencia de nucleótidos modificados, fue posible demostrar que los fosforotioatos se toleran tanto en la hebra codificante como no codificante al igual que 2’-fluorouracilo en lugar de uracilo. 2’-Aminouracilo y 2’-aminocitidina reducen laactividad de iARN cuando se incorporan a la hebra codificante y la actividad se pierde completamente cuando se incorporan a la hebra no codificante. Al cambiar uracilo a 2’-desoxitimidina en la hebra codificante, también sereduce el efecto, e incluso más cuando el cambio es en la hebra no codificante. Si una o ambas hebras están formadas completamente por monómeros de ADN, la actividad de iARN se pierde totalmente. En el estudio mencionado anteriormente, también se investigaron modificaciones en las bases; se encontró que 4-tiouracilo y 5bromouracilo se toleran en ambas hebras, mientras que 5-yodouracilo y 5- (3-aminoalil) uracilo reducen el efecto en la hebra codificante e incluso más en la hebra no codificante. Al sustituir la guanosina por inosina, se reduce mucho laactividad, independientemente de si la modificación se realiza en la hebra codificante o en la no codificante.

Sin embargo, las protuberancias de UU en 3’ pueden intercambiarse por protuberancias de 2’desoxitimidina en 3' yse toleran bien (Elbashir y cols., Nature, 2001, 411, 494-498 y Boutla y cols., Curr. Biol., 2001, 11, 1776-1780) .

También se ha demostrado que pueden incorporarse monómeros de ADN en la hebra codificante sin poner en peligro la actividad.

Elbashir y cols., (EMBO, 2001, 20, 6877-6888) demostraron que los ARNpi modificados que contenían cuatro desoxinucleótidos en cada extremo 3' del ARNpi mantenían toda la actividad. Además, se encontró que la actividad se eliminaba si el ARNpi contenía solo un emparejamiento de bases incorrecto en "mitad" de la molécula.

Sin embargo, también se reseñó que pueden tolerarse 1-2 emparejamientos incorrectos siempre que los emparejamientos incorrectos se introduzcan en la hebra codificante (Holen y cols., NAR, 2002, 30, 1757-1766; Hohjoh, FEBS Lett., 2002, 26179, 1-5; Hamada y cols., Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309; yBoutla y cols., Curr. Biol., 2001, 11, 1776-1780) ) .

Nyk5nen y cols. (Cell, 2001, 107, 309-321) demostraron la necesidad de ATP para producir ARNpi de iARN, pero también en las posteriores etapas para desarrollar la actividad de los ARNpi. El ATP es necesario para desenrollar y mantener un 5’-fosfato para el reconocimiento por RISC. El 5’-fosfato es necesario para la actividad de ARNpi.Martínez y cols. (Cell, 2002, 110, 563-574) demostraron que una única hebra puede reconstituir el complejo silenciador inducido por ARN (RISC, Hammond y cols., Nature, 2000, 404, 293-296) y que una única hebra no codificante tiene actividad especialmente cuando está 5’-fosforilada. La modificación en 5’ de la hebra no codificante, inhibe la actividad aunque puede modificarse tanto el extremo 3’ como el extremo 5’ de la hebra codificante.

Amarzguioui y cols. (NAR, 2003, 31, 589-595) confirmaron los hallazgos mencionados anteriormente y se concluyó que se toleraba un emparejamiento incorrecto siempre que no estuviera demasiado cerca del extremo 5’ de la hebra no codificante. Un emparejamiento incorrecto a 3-5 nucleótidos del extremo 5' de la hebra no codificante disminuye la actividad de forma notable. Sin embargo, se demostró que se toleran dos emparejamientos incorrectos si están en "medio" o hacia el extremo 3' de la hebra no codificante, aunque con una actividad ligeramente menor.

Se han introducido modificaciones, como por ejemplo fosforotioatos y 2’-O-metil ARN, en los extremos de ARNpi (Amarzguioui y cols., NAR, 2003, 31, 589-595) y se toleraban bien. La 2’-O-alilación reduce el efecto cuando está presente en el extremo 5' de la hebra no codificante El análogo nucleosídico bicíclico ENA (2’-0, 4’-C-etilentimidina (ENA timidina, eT) también ha sido incorporado al ARNpi (Hamada y cols., Antisense and Nucl. Acid Drug Dev., 2002, 12, 301-309) . Se demostró que dos ENA timidinas en el extremo 5' de la hebra codificante deterioraban el efecto. Hamada y cols. (2002) concluyeron que: "al usar 2’-O, 4’-C -etilen timidina, que es un componente de los ácidos nucleicos con puentes de etileno (ENA) , seelimina completamente la iARN".

Más recientemente, un número de ARNpi que contenían monómeros de LNA incorporados se describieron por Braasch y cols. (Biochemistr y 2003, 42, 7967-7975) .

En conclusión, se ha demostrado que la hebra no codificante es más sensible a las modificaciones que la hebra codificante. Sin limitarse a ninguna teoría específica, se cree... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto bicatenario que comprende una hebra codificante y una hebra no codificante, en el que cada hebra comprende 17-25 nucleótidos y en el que dicho compuesto comprende al menos un monómero de ácido nucleico cerrado (LNA) que tiene la estructura en las que X es seleccionado del grupo que consiste en O, S y NRH, en el que RH es H o alquilo C1-4;

Y es CH2;

B es una nucleobase;

Z y Z* están independientemente ausentes o son seleccionados independientemente del grupo que consiste en un grupo de enlace internucleosídico, un grupo terminal y un grupo protector; de forma que cuando el monómero de LNA está localizado en el extremo 3', Z es un grupo terminal y Z* es un grupo de enlace internucleosídico; cuando elmonómero de LNA está localizado en el extremo 5', Z está ausente y Z* es un grupo terminal; y cuando el monómero de LNA está localizado dentro de la secuencia de nucleótidos, Z está ausente y Z* es un grupo de enlace internucleosídico y

en el que ningún monómero de LNA está localizado en el extremo 5' de la hebra no codificante.

2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la hebra codificante comprende 1-10 monómeros de LNA.

3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que al menos un monómero de LNA está 20 localizado en el extremo 5' de la hebra codificante.

4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que al menos dos monómeros de LNA están localizados en el extremo 5' de la hebra codificante.

5. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un monómero de LNA está localizado en el extremo 3' de la hebra codificante.

6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en el que al menos dos monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra codificante.

7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la hebra no codificante comprende 1-1030 monómeros de LNA.

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que al menos un monómero de LNA está localizado en el extremo 3' de la hebra no codificante.

10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en el que al menos dos monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra no codificante.

11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10, en el que al menos tres monómeros de LNA están localizados en el extremo 3' de la hebra no codificante.

12. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la hebra codificante comprende al menos un LNA y la hebra no codificante comprende al menos un monómero de LNA.

13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la hebra codificante comprende 1-1040 monómeros de LNA y la hebra no codificante comprende 1-10 monómeros de LNA.

14. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que la hebra codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 5' y al menos un monómero de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra no

codificante comprende al menos un monómero de LNA en el extremo 3'.

15. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la hebra codificante comprende al menos unmonómero de LNA en el extremo 5' y al menos un monómero de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra nocodificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3'.

16. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la hebra codificante comprende al menos dosmonómeros de LNA en el extremo 5' y al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra nocodificante comprende al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3'.

17. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la hebra codificante comprende al menos dos

monómeros de LNA en el extremo 5' y al menos dos monómeros de LNA en el extremo 3' y en el que la hebra no10 codificante comprende al menos tres monómeros de LNA en el extremo 3'.

18. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la hebra codificantecomprende al menos un monómero de LNA en al menos una de las posiciones 9-13 contadas a partir del extremo 5'.

19. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la hebra codificante comprende un monómerode LNA en la posición 10.

20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en el que la hebra codificante comprende un monómero de LNA en la posición 11.

21. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que la hebra codificante comprende un monómero de LNA en la posición 12.

22. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada hebra 20 comprend.

2. 22 nucleótidos.

23. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una de las hebras tiene una protuberancia en 3'.

24. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la hebra codificante tiene una protuberancia en 3’.

25. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 23 o 24, en el que la hebra no codificante tiene una protuberancia en 3’.

26. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 25, en el que las protuberancias en 3’ son de 1-3 nucleótidos.

27. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 26, en el que tanto la hebra codificante como la no

codificante comprenden dichas protuberancias en 3’, en el que cada hebra comprende 17-25 nucleótidos; en el que la hebra codificante tiene uno o dos monómeros de LNA en el extremo 5' y uno o dos monómeros de LNA en elextremo 3'; y en el que la hebra no codificante tiene uno o dos monómeros de LNA en el extremo 3'.

28. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en el que ningún monómero de LNA está localizado a 1, 2 o 3 nucleótidos del extremo 5' de la hebra no codificante.

29. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X es seleccionado del grupo que consiste en O, S y NH.

30. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 29, en el que X es O.

31. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho monómero de LNA está en la forma beta-D.

32. Un conjugado que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-31 enlazado a uno o más ligandos.

33. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-31 o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 32 y un diluyente, vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

34. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-31 o el conjugado de acuerdo con la reivindicación 32, para su uso como medicamento.

(tipo N)

(tipo S)

Proporción normalizadaNPY/Ciclina (control interno) Proporción normalizadaLuciérnaga/Renilla Proporción normalizadaLuciérnaga/Renilla Infectado No infectado Tratamiento:

Simulado Después de la bomba Antes de la bomba