MOLECULAS Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES ASOCIADAS CON MCP-1/CCR2.

Una molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácido de CCR2 que es capaz de unirse a MCP-1,

dicha secuencia de aminoácido de CCR2 se describe en la SEQ ID NO: 2 y en donde la molécula es no-inmunógena y esta desprovista de un dominio N-terminal de CCR

Moléculas y métodos de uso de las mismas para el tratamiento de enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2.

La presente invención se refiere a una molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácidos de CCR2, de acuerdo con la reivindicación 1, una molécula de acuerdo con la reivindicación 3, una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, el uso de la molécula de la reivindicación 1, de acuerdo con la reivindicación 5, un método de aislamiento de MCP-1 a partir de una muestra biológica de acuerdo con la reivindicación 6.

La presente invención se relaciona con moléculas novedosas y, más particularmente, con métodos para tratar enfermedades asociadas con MCP-1/CCR2, tales como enfermedades inflamatorias y cáncer.

En los últimos años, un número creciente de factores de activación/quimioatrayente del leucocito (quimioquinas) se describen [Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Schall and Bacon, Curr. Opin. Immunol., 6:865-873 (1994); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-1-79 (1994)]. Las quimioquinas se producen y secretan por una gran variedad de tipos de células en respuesta a mediadores inflamatorios primarios tales como IL-1ß o TNF-a.

La superfamilia de quimioquinas comprende dos ramas principales: las a-quimioquinas (también conocidas como las quimioquinas CXC) y las ß-quimioquinas (también conocidas como las quimioquinas CC). Esta clasificación se basa en, sí las primeras dos cisteinas en la secuencia de aminoácidos se separan por un sólo aminoácido (CXC) o son adyacentes (CC), La rama de la a-quimioquina incluye las proteínas tales como IL-8, neutrófilo que activa el péptido-2 (NAP-2), actividad estimulatoria del crecimiento del melanoma (MGSA/gro o GRO a), y ENA-78, cada una de los cuales tiene ambos efectos de atracción y activación predominantemente sobre los neutrófilos y linfocitos T. Los miembros de la rama ß-quimioquina, afecta otros tipos de células de sangre tales como monocito, linfocitos, basófilos, y eosinófilos [Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller and Krangel, Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992); Jose, P. J., et al., J. Exp. Med., 179:881-118 (1994); Ponath, P. D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)], e incluyen proteínas tales como proteínas quimioatrayentes de los monocitos 1-4 (MCP-1, MCP-2, MCP-3, y MCP-4), RANTES, y proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1a y MIP-1ß).

Una tercera rama más pequeña de la superfamilia de la quimioquina comprende las quimioquinas unidas a la membrana. Los miembros de esta clase se denominan quimioquinas CX3C [Bazan, J. F., et al., Nature 385:640-644 (1997)].

Las quimioquinas pueden mediar un rango de efectos pro-inflamatorios en leucocitos, tales como estimulación de la quimiotaxia, degranulación, síntesis de mediadores de lípidos, y activación de la integrina [Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Inmunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller, M. D. and Krangel, M. S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)].

Las quimioquinas se unen a receptores de la superficie celular específicos que pertenecen a la familia de proteínas de siete dominios transmembrana acoplados a la proteína G [Murphy, P. M., Annu. Rev. Immunol., 12:593-633 (1994)] que se denominan "receptores de quimioquinas". En unión de sus ligandos cognados, los receptores de quimioquinas transducen una señal intracelular aunque las proteínas G triméricas asociadas, dando lugar a, entre otras respuestas, un aumento rápido en la concentración de calcio intracelular, cambios en la forma de la célula, aumento de la expresión de moléculas de adhesión celular, degranulación, y promoción de la migración celular.

Las quimioquinas se han implicado como mediadores importantes de trastornos alérgicos, inflamatorios y autoinmunes y enfermedades, tales como asma, aterosclerosis, glomerulonefritis, pancreatitis, restenosis, artritis reumatoide, nefropatía diabética, fibrosis pulmonar, y el rechazo de trasplantes.

En particular, proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), que actúa sobre su receptor del Receptor de la Quimioquina CC 2 (CCR-2), juega un papel en una gran variedad de indicaciones. Al unirse con su receptor, MCP-1 induce un aumento rápido en la concentración de calcio intracelular, lo que conduce a un aumento de la expresión de moléculas de adhesión celular y, eventualmente, a la degranulación celular y la promoción de la migración del leucocito.

La demostración de la importancia de la interacción MCP-1/CCR-2 ha sido suministrada por experimentos con ratones modificados genéticamente. Los ratones-/-MCP-1 tienen números normales de leucocitos y macrófagos, pero fueron incapaces de reclutar monocitos en sitios de inflamación, después de varios tipos diferentes de desafíos inmunes [Bao Lu, et al., J. Exp. Med. 1998, 187, 601]. De igual modo, los ratones-/-CCR-2 fueron incapaces de reclutar monocitos o producir el interferon ? cuando se desafían con diversos agentes exógenos; por otra parte, los leucocitos de ratones mutantes CCR-2, no migraron en respuesta a MCP-1 [Landin Boring, et al., J. Clin. Invest. 1997, 100, 2552], lo que demuestra la especificidad de la interacción MCP-1/CCR-2. Otros dos grupos han reportado independientemente resultados equivalentes con cepas diferentes de ratones-/-CCR-2 [William A. Kuziel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 12053, and Takao Kurihara, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 1757]. La viabilidad y por lo general la salud normal de los animales-/MCP-1 y -/-CCR-2 es notable, en aquella alteración de la interacción MCP-1/CCR-2 no se induce la crisis fisiológica. En conjunto, estos datos sugieren que las moléculas que bloquean las acciones de MCP-1 serían útiles en el tratamiento de un rango de trastornos inflamatorios y autoinmunes.

Se sabe que la MCP-1 se aumenta en pacientes con artritis reumatoide [Alisa Koch, et al., J. Clin. Invest. 1992, 90, 772-779]. Por otra parte, varios estudios han demostrado el valor terapéutico potencial de antagonismo de la interacción MCP-1/CCR2 en el tratamiento de la artritis reumatoide. Una vacuna de ADN que codifica MCP-1 se mostró recientemente para mejorar la artritis crónica inducida por poliadyuvante en ratas [Sawsan Youssef, et al., J. Clin. Invest. 2000, 106, 361]. De igual modo, los síntomas de enfermedad inflamatoria podrían ser controlados vía administración directa de anticuerpos para MCP-1 a ratas con artritis inducida por colágeno [Hiroomi Ogata, et al., J. Pathol. 1997, 182, 106], o artritis inducida por pared celular de estreptococo [Ralph C. Schimmer, et al., J. Immunol. 1998, 160, 1466]. Quizás lo más importante, un antagonista de péptido de MCP-1, MCP-1 (9-76), se mostró tanto para prevenir la aparición de la enfermedad como para reducir los síntomas de la enfermedad (dependiendo del tiempo de administración) en el modelo de ratón MRL-1pr de la artritis [Jiang-Hong Gong, et al., J. Exp. Med. 1997, 186, 131].

MCP-1 también se aumenta en lesiones ateroscleróticas, y se ha demostrado que los niveles circulantes de MCP-1, juegan un papel en progreso de la enfermedad [Abdolreza Rezaie-Majd, et al, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2002, 22, 1194-1199]. MCP-1 es responsable del reclutamiento de monocitos en áreas ateroscleróticas, como se muestra por inmunohistoquímica de pared arterial rica en macrófagos [Yla-Herttuala et al., Proc Natl Acad Sci USA 88:5252-5256 (1991); Nelken et al., J Clin Invest 88:1121-1127 (1991)] y la detección del anticuerpo anti-MCP-1 [Takeya et al., Human Pathol 24:534-539 (1993)]. Ratones del receptor LDL/MCP-1-deficiente y apoB-transgénico/MCP-1-deficiente muestran deposición de lípidos significantemente menor y acumulación de macrófago a lo largo de sus aortas en comparación con cepas MCP-1 de tipo salvaje [Alcami et al., J Immunol 160: 624-633 (1998); Gosling et al., J Clin Invest 103:773-778 (1999); Gu et al., Mol. Cell. 2:275-281 (1998); Boring et al., Nature 394:894-897 (1998)].

Se sabe que MCP-1 se aumenta en la esclerosis múltiple humana, y se ha demostrado que la terapia eficaz con el interferonß-1ß reduce la expresión de MCP-1 en las células mononucleares de la sangre periférica, lo que sugiere que MCP-1 juega un papel en el progreso de la enfermedad [Carla Iarlori, et al., J. Neuroimmunol. 2002, 123, 170-179]....

1. Una molécula que comprende una secuencia de inmunoglobulina conjugada con una secuencia de aminoácido de CCR2 que es capaz de unirse a MCP-1, dicha secuencia de aminoácido de CCR2 se describe en la SEQ ID NO: 2 y en donde la molécula es no-inmunógena y esta desprovista de un dominio N-terminal de CCR2.

2. La molécula de la reivindicación 1, que además comprende una etiqueta unida a esta.

3. Una molécula según se describe en la SEQ ID NO: 14 o 15.

4. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

5. Uso de la molécula de la reivindicación 1, para la fabricación de un medicamento identificado para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de enfermedades inflamatorias, necrosis, aterosclerosis, cáncer, esclerosis múltiple, ateroma, leucemia monocítica, enfermedades de riñón (por ejemplo, glomerulonefritis), síndrome de hamman-rich, endometriosis, artritis reumatoide, bronquiolitis, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades inflamatorias intestinales (por ejemplo, colitis), alveolitis, restinosis, trauma cerebral, psoriasis, fibrosis pulmonar idiopática y arteriosclerosis de trasplantes.

6. Un método de aislamiento de MCP-1 de una muestra biológica, método que comprende;

(a) poner en contacto la muestra biológica con la molécula de la reivindicación 2, de tal manera que MCP-1 y la molécula de la reivindicación 2 formen un complejo; y

(b) aislamiento de dicho complejo, para así aislar MCP-1, a partir de la muestra biológica.

7. La molécula de la reivindicación 2, en donde dicha etiqueta es una etiqueta de epitope.

8. La molécula de la reivindicación 2, que además se une a un soporte sólido.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable se formula para administración parenteral.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable es sustancialmente no-inmunógeno.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende un ácido lipoamina.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende un carbohidrato.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende una microesfera.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende un liposoma.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde dicho portador farmacéuticamente aceptable comprende una microesfera de polímero.

16. El uso de la reivindicación 5, en donde dicha molécula es como se describe en la SEQ ID NO: 14 o 15.