ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO ESPECIFICO PARA LIPOPOLISACARIDOS (LPS) DE SEROTIPO IATS 011 DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA.

Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS 011 de P.

aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena pesada en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, o una muteína de dicho anticuerpo capaz de unirse a dicho LPS, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:8

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal 5 humano específico para el serotipo IATS O11 de P. aeruginosa, un hibridoma que lo produce, ácidos nucleicos que lo codifican y células huésped transfectadas con los mismos. Además, la presente invención se refiere a métodos para producir dicho anticuerpo monoclonal. Además, la presente invención se refiere 10 a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo o al menos un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo.

P. aeruginosa es una bacteria medioambiental ubicua Gram negativa que se encuentra en el agua dulce y la tierra. Es un 15 patógeno oportunista clásico que normalmente no representa una amenaza al huésped inmunocompetente, que lo elimina por medio de anticuerpos opsonizantes y fagocitosis. Sin embargo, los pacientes de fibrosis quística e individuos inmunodeprimidos – incluyendo víctimas de quemaduras, pacientes entubados en las 20 UCI, pacientes de cáncer y SIDA, así como pacientes sometidos a trasplante de órganos- tienen particularmente alto riesgo de contraer infecciones nocosomiales. Junto con S. aureus resistente a meticilina (SARM) y enterococos resistentes a vancomicina (ERV), P. aeruginosa es responsable de hasta el 34% 25 de todas las infecciones nocosomiales que han aumentado desde 7,2/1000 pacientes día en 1975 hasta 9,8/1000 pacientes día en 1995. Entre las formas de infección nocosomial observadas con mayor frecuencia están la bacteriemia y la neumonía.

Para la prevención de infecciones crónicas por P. 30 aeruginosa en pacientes de fibrosis quística, se ha establecido una vacuna octavalente conjugada que consiste en los 8 serotipos de LPS más relevantes de P. aeruginosa acoplados a toxina A detoxificada de P. aeruginosa para la inmunización activa. Los estudios a largo plazo con esta vacuna han mostrado que la 35 proporción de pacientes infectados de forma crónica cayó desde

alrededor del 72% hasta el 32% a la edad de 18 años. Sin embargo, la vacunación activa solo es posible en pacientes inmunocompetentes, así como en situaciones previsibles. De esta manera, la mayoría de las víctimas de P. aeruginosa no se pueden inmunizar activamente con la vacuna octavalente. Debido a esto y 5 debido al hecho de que la mayoría de las cepas de P. aeruginosa son multirresistentes, existe una necesidad para una herramienta terapéutica alternativa para tratar a los pacientes infectados con P. aeruginosa. Un intento es crear anticuerpos monoclonales humanos basados en la tecnología clásica de hibridomas o usando 10 clonación de repertorio por presentación en fagos.

Ambos métodos y los anticuerpos creados mediante los mismos muestran serios inconvenientes.

La tecnología clásica del hibridoma (el planteamiento de “Kohler y Milstein”) se basa en la inducción de células B 15 murinas de la especificidad deseada mediante inmunización activa con un antígeno de elección e inmortalización mediante fusión con un compañero de mieloma. Después de ello, la información genética de un clon productor de anticuerpo necesita humanizarse mediante ingeniería genética y producir el anticuerpo en un 20 sistema de expresión adecuado. Asimismo, la clonación de un repertorio de presentación en fago requiere una manipulación genética sofisticada del anticuerpo y el establecimiento de un sistema de expresión adecuado.

Se sabe que los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos 25 contra LPS bacteriano reconocen epítopos diferentes que los anticuerpo humanos. Por lo tanto, la generación de anticuerpos monoclonales en ratones seguida por humanización no produciría necesariamente el aislamiento de anticuerpos con la especificidad de interés para su uso en seres humanos. 30

Además, los anticuerpos de isotipo IgM son los más eficaces debido a los mecanismos efectores ligados a IgM que son óptimos para la inmunidad antibacteriana. Sin embargo, hasta la fecha no se ha alcanzado la expresión recombinante de anticuerpos IgM debido a la forma pentamérica compleja de esta molécula. Por 35 consiguiente, la expresión de anticuerpos aislados mediante la

tecnología de presentación en fago está limitada a isotipos diferentes de IgM.

De forma alternativa, han existido diferentes intentos de generar anticuerpos monoclonales humanos contra grupos de LPS de P. aeruginosa. Sin embargo, bien los métodos usados para 5 producir dichos anticuerpos tenían desventajas (debido a la inestabilidad de las células linfoblastoides) o bien los anticuerpos mostraron un patrón de glicosilación no humano o se requerían cantidades muy grandes del anticuerpo. Además, muchos de los anticuerpos descritos en la técnica anterior carecen de 10 funciones efectoras y por tanto no eran protectores.

Según esto, un problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal humano específico para LPS de un serotipo particular de P. aeruginosa en donde el anticuerpo muestra gran capacidad de protección, en 15 particular in vivo.

El problema técnico se resuelve mediante los anticuerpos monoclonales humanos como se definen a continuación.

Según la presente divulgación, se proporciona un anticuerpo monoclonal humano denominado 1BO11, específico para LPS del 20 serotipo IATS O11 de P. aeruginosa en donde la región variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende al menos una de SEQ ID NO:1 en la región CDR1, SEQ ID NO:2 en la región CDR2 y SEQ ID NO:3 en la región CDR3, y en donde la región variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende al menos una de SEQ ID 25 NO:4 en la región CDR1, SEQ ID NO:5 en la región CDR2 y SEQ ID NO:6 en la región CDR3; o un fragmento o derivado del mismo capaz de unirse a dicho LPS.

La presente invención proporciona además un hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal y los ácidos nucleicos que 30 codifican la cadena ligera y pesada del anticuerpo, respectivamente. Además, la presente invención proporciona vectores y células huésped, que comprenden el ácido nucleico. Además, se proporcionan métodos para producir los anticuerpos monoclonales. Además, se proporcionan composiciones 35

farmacéuticas que comprenden al menos un anticuerpo y/o al menos un ácido nucleico, y segundos usos médicos de las mismas.

Sorprendentemente, se ha determinado que los anticuerpos monoclonales humanos según la invención muestran gran capacidad de protección. En particular, se demostró que el anticuerpo 5 monoclonal humano era opsonofagocítico in vitro. Incluso más importante, los anticuerpos monoclonales según la presente invención muestran capacidad de protección in vivo determinada por la protección a bacteriemia en el modelo murino de quemaduras así como protección de infección en el aparato 10 respiratorio en un modelo de infección pulmonar aguda en ratones como se muestra en los ejemplos.

Con los anticuerpos monoclonales humanos según la invención, se alcanza la opsonofagocitosis a dosis mucho más bajas así como una mayor protección comparada con los 15 anticuerpos monoclonales humanos descritos por Collins y col. (Collins MS et al., 1990. FEMSIM 64:263-268).

En contraste con los anticuerpos monoclonales descritos en el estado de la técnica (Harrison FJJ et al. 1997. Hybridoma 16(5):413-420; Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 20 56(8):1873-1879), los anticuerpos monoclonales humanos según la invención se generan además a partir de sangre de individuos sanos activamente inmunizados con una vacuna conjugada. En general se sabe que los anticuerpos contra polisacáridos son de menor calidad (es decir, baja afinidad con poco potencial 25 efector) debido a la falta de ayuda de células T. Sólo mediante el uso de una vacuna conjugada se pueden generar anticuerpos valiosos que tengan gran afinidad con gran potencial efector contra dianas polisacáridos. Además, la tasa de producción de anticuerpos monoclonales humanos según la invención es mayor 30 comparada con la tasa de producción de anticuerpos monoclonales descritos en el estado de la técnica (Zweerink HJ et al. 1988. Infection and Immunity 56(8):1873-1879).

En el estado de la técnica no se ha descrito ningún anticuerpo monoclonal humano que muestre protección para 35 infección pulmonar producida por P. aeruginosa.

Según la presente invención el anticuerpo es específico para el LPS del serotipo IATS O11 de P. aeruginosa y muestra actividad opsonofagocítica a concentraciones tan bajas como 0,1 ng/ml determinadas usando bacterias...

1. Anticuerpo monoclonal humano específico para el lipopolisacárido (LPS) del serotipo IATS 011 de P. aeruginosa que comprende una cadena ligera y una cadena 5 pesada en donde la región variable de la cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7 y la región variable de la cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:8, o una muteína de dicho anticuerpo capaz de unirse a dicho LPS, en donde la 10 secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo es al menos el 95% homóloga a SEQ ID NO:8. 15

2. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 1 en donde la cadena ligera es de tipo kappa.

3. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 1 en donde 20 la cadena ligera es de tipo lambda.

4. Anticuerpo monoclonal humano de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la cadena pesada es del tipo IgM, IgA o IgG.

25

5. Anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 4 en donde la cadena pesada es del tipo IgM.

6. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el anticuerpo consiste 30 completamente en secuencia de aminoácidos humana.

7. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el anticuerpo muestra reconocimiento antigénico humano. 35

8. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el anticuerpo está modificado en el N-terminal, internamente y/o en el C-terminal, en donde la modificación se selecciona de al menos una de oligo, di- o polimerización, modificaciones de las 5 cadenas laterales, modificaciones postraduccionales y conjugación a un fármaco y/o un marcador.

9. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 obtenible de una célula B humana o un 10 hibridoma obtenido mediante fusión de dicha célula B humana con una célula de mieloma o heteromieloma.

10. Hibridoma capaz de producir el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9. 15

11. Ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano y la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9. 20

12. Vector que comprende el ácido nucleico que codifica la cadena ligera y la cadena pesada de la reivindicación 11.

13. Vector según la reivindicación 12, en donde el vector 25 también comprende un promotor operativamente unido al ácido nucleico para facilitar la expresión del mismo.

14. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 12 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 11. 30

15. Un método para producir el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 ó 9 que comprende cultivar el hibridoma de la reivindicación 10 bajo condiciones que permiten la secreción de un anticuerpo o 35 cultivar la célula huésped de la reivindicación 14 en

condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo monoclonal humano y, opcionalmente, purificar el anticuerpo del sobrenadante del cultivo.

16. Composición farmacéutica que comprende al menos un 5 anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o al menos un ácido nucleico de la reivindicación 11 y, opcionalmente, ingredientes farmacéuticamente aceptables.

10

17. Anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o el ácido nucleico de la reivindicación 11 para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una infección de P. aeruginosa en un paciente humano.

15

18. Uso del anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o del ácido nucleico de la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de una infección por P. aeruginosa en un paciente humano. 20

19. Anticuerpo monoclonal humano y/o el ácido nucleico para el uso según la reivindicación 17 o el uso según la reivindicación 18 en donde la infección por P. aeruginosa es una infección intrahospitalaria. 25

20. Kit de prueba para el diagnóstico de una infección por P. aeruginosa en una muestra que comprende al menos un anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y/o al menos un ácido nucleico de la 30 reivindicación 11, y opcionalmente, ingredientes adecuados adicionales para llevar a cabo la prueba de diagnóstico.