PEPTIDOS CON CAPACIDAD DE PENETRACION CELULAR Y SUS USOS.

Péptidos con capacidad de penetración celular y sus usos.Los péptidos,

o sales farmacéutica o biológicamente aceptables de los mismos, comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I) donde: aa, es histidina o isoleucina; aa2 representa un aminoácido espaciador; n=0 ó 1, y los aminoácidos que constituyen el péptido son L-aminoácidos, estando dichos aminoácidos posicionados en la secuencia peptídica en el orden indicado en la fórmula (I) o bien en el orden inverso.Dichos péptidos translocan y penetran la membrana celular, dirigiéndose de manera específica al nucléolo. Estas propiedades lo hacen útil como sistema de direccionamiento de una segunda molécula al nucléolo

Péptidos con capacidad de penetración celular y sus usos.

La presente invención se refiere a péptidos que tienen la capacidad de penetrar y translocarse a través de la membrana celular. Dichos péptidos se pueden usar, conjugados a una segunda molécula, como sistemas de liberación celular o de direccionamiento al nucléolo.

Estado de la técnica anterior

Los denominados péptidos de penetración celular (de aquí en adelante también referidos como "CPP") son secuencias peptídicas, generalmente de longitud reducida (15 a 25 aminoácidos), de naturaleza catiónica y estructura anfipática, con una elevada afinidad por las membranas lipídicas y por los proteoglicanos de superficie de membrana. Los miembros de esta clase de péptidos biológicos activos son capaces de translocar membranas celulares, localizarse en diferentes compartimentos celulares y, en la mayoría de casos, mediar la liberación intracelular de cargamentos tales como agentes de diagnóstico por imagen, biomoléculas poliméricas (ácidos nucleicos, oligonucleótidos, polipéptidos), liposomas, fármacos o nanopartículas. Es por esto que dichos péptidos son de interés en sectores tales como el farmacéutico o diagnóstico, entre otros.

Los primeros péptidos de penetración celular reconocidos fueron el transactivador de transcripción procedente del virus HIV-1, denominado proteína Tat, y el homeodominio Antennapedia (Antp) procedente de Drosophila. Más tarde se demostró que fragmentos cortos de la proteína Tat (p.e. Tat_47-57 Y Tat_48-60) y un fragmento de 16 aminoácidos de Antp (Antp_43-58, denominado "Penetratina") tenían la capacidad de translocar a través de la membrana plasmática (cf. Derossi D. et al., "The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes", J. Biol. Chem., 1994, vol. 269(14), p. 10444-10450). A partir de entonces, se ha identificado un número elevado de péptidos naturales y sintéticos que se utilizan para translocar y liberar en el citoplasma celular y en el núcleo distintos tipos de moléculas, ya sea in vitro o in vivo.

Por otro lado, debido a sus características físico-químicas (longitud corta, carga catiónica, naturaleza anfipática y estructuras secundarias ordenadas), y al mecanismo general de captación celular, los péptidos antimicrobianos (AMPs) comparten algunas propiedades con los CPPs, tales como la fuerte interacción con componentes de las bicapas lipídicas, capacidad de penetración celular y direccionamiento a compartimentos celulares. Por ejemplo, se ha publicado recientemente que el péptido antimicrobiano humano histatina 5 transloca en el citoplasma de Leishmania y se acumula en la mitocondria, donde ejerce su efecto biológico.

Las secuencias peptídicas con tales características de penetración y de direccionamiento celular ofrecen interesantes posibilidades de aplicación como sistemas de administración direccionables de fármacos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, como el cáncer (cf. Murphy E. A. et al., "Nanoparticle-mediated drug delivery to tumor vasculature suppresses metastasis", Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2008, vol. 105 (27), p. 9343-9348) o la artritis (cf. Szekanecz Z. et al., "Mechanisms of Disease: angiogenesis in inflammatory diseases", Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 2007, vol. 3(11), p. 635-643).

Aunque la carga catiónica y el carácter anfipático son dos requisitos físico-químicos determinantes de la capacidad de penetración celular a través de la membrana bien reconocidos de los CPPs, sigue siendo aun difícil predecir si una secuencia determinada podrá translocar o no la membrana (cf. Hansen M. et al., "Predicting cell-penetrating peptides", Adv. Drug Deliv. Rev., 2008, vol. 60(4-5), p. 572-579).

Además, existe todavía la necesidad de secuencias peptídicas translocadoras que permitan el direccionamiento hacia compartimentos celulares específicos.

Explicación de la invención

Los inventores han diseñado nuevos péptidos, los cuales tienen la capacidad de translocarse y penetrar la membrana celular. Además, sorprendentemente, cuando se conjuga una segunda molécula a dichos péptidos, ésta es transportada de manera específica al núcleo y, en particular al nucléolo.

Así, en un primer aspecto la presente invención se refiere a un péptido, o a una sal farmacéutica o biológicamente aceptable del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

(I)Tyr-Lys-Gln-Cys-(aa₁)-Lys-Lys-Gly-Gly-(aa₂)_n-Lys-Lys-Gly-Ser-Gly

donde

aa₁ es histidina o isoleucina,

aa₂ representa un aminoácido espaciador,

n = 0 ó 1, y

los aminoácidos que constituyen el péptido son L-aminoácidos, estando dichos aminoácidos posicionados en la secuencia peptídica en el orden indicado en la fórmula (I) o bien en el orden inverso.

De esta manera, el péptido de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos N(t)-Tyr-Lys-Gln-Cys-(aa)-Lys-Lys-Gly-Gly-(aa₂)_n,-Lys-Lys-Gly-Ser-Gly-C(t) (que corresponde al orden indicado en la fórmula (I)) o bien la secuencia de aminoácidos N(t)-Gly-Ser-Gly-Lys-Lys-(aa₂)_n-Gly-Gly-Lys-Lys-(aa)-Cys-Gln-Lys-Tyr-C(t) (que corresponde a la secuencia de aminoácidos de fórmula (I) pero en el orden inverso).

Los péptidos descritos en el presente documento se pueden preparar mediante cualquiera de los procedimientos conocidos incluyendo, pero no limitándose a, síntesis en fase sólida, síntesis en solución, expresión de proteína mediante un hospedador transformado, escisión de un polipéptido sintético, semisintético o derivado de la naturaleza o una combinación de estas técnicas.

Los péptidos según la presente invención también pueden obtenerse por métodos conocidos en forma de sus sales farmacéutica y/o biológicamente aceptables, como la sal sódica, la sal potásica, la sal cálcica, la sal magnésica y sales de adición con ácidos. Ejemplos de sales incluyen las sales de ácidos inorgánicos (p.ej. ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico) y de ácidos orgánicos (p.ej. ácido acético, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido málico y ácido metanosulfónico).

De la misma manera, forman parte de la presente invención péptidos con la secuencia de aminoácidos en el orden indicado en la fórmula (I), o bien en el orden inverso, sujetos a adiciones o sustituciones de uno o más aminoácidos por otros aminoácidos seleccionados de entre los aminoácidos naturales y los no naturales/modificados conocidos. La sustitución de aminoácidos puede ser conservativa (i.e. se sustituye uno o más aminoácidos por uno o más aminoácidos con propiedades físico-químicas similares) o no conservativa (i.e. se sustituye uno o más aminoácidos por uno o más aminoácidos con propiedades físico-químicas diferentes). Dichas sustituciones o adiciones no deben afectar a las propiedades de penetración, translocación y especificidad nucleolar características de los péptidos descritos en el presente documento.

Por "aminoácido espaciador" se entiende un ω-aminoácido no natural o modificado, de cadena lineal de hasta 6 átomos de carbono, con el grupo amino en el carbono más alejado del grupo carboxilo. Dicho aminoácido espaciador se encuentra intercalado en la secuencia peptídica de fórmula (I). Ejemplos ilustrativos y no limitativos de aminoácidos espaciadores son la β- alanina (ácido 3-aminopropiónico), el ácido 4-aminobutírico, el ácido 5-aminopentanoico, o el ácido 6-aminohexanoico (ácido 6-aminocaproico), entre otros). Preferiblemente, el aminoácido espaciador es el ácido aminohexanoico.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el péptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

SEC ID NO. 1:

N(t)Tyr-Lys-Gln-Cys-His-Lys-Lys-Gly-Gly-Lys-Lys-Gly-Ser-GlyC(t);

SEC...

1. Péptido, o una sal farmacéutica o biológicamente aceptable del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

(I)Tyr-Lys-Gln-Cys-(aa₁)-Lys-Lys-Gly-Gly-(aa₂)_n-Lys-Lys-Gly-Ser-Gly

donde

aa, es histidina o isoleucina,

aa₂ representa un aminoácido espaciador,

n = 0 ó 1, y

los aminoácidos que constituyen el péptido son L-aminoácidos, estando dichos aminoácidos posicionados en la secuencia peptídica en el orden indicado en la fórmula (I) o bien en el orden inverso.

2. Péptido según la reivindicación 1, en donde aa₂ es el ácido aminohexanoico.

3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO. 1, SEC ID NO. 2, SEC ID NO. 3 y SEC ID NO. 4.

4. Conjugado que comprende el péptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unido a una segunda molécula.

5. Conjugado según la reivindicación 4, en donde dicha segunda molécula se selecciona del grupo que consiste en: ácidos nucleicos, nucleósidos, residuos glicosídicos, marcadores detectables y fármacos.

6. Conjugado según la reivindicación 5, en donde dicha segunda molécula es un marcador detectable.

7. Procedimiento de visualización de células, tejidos y órganos que comprende administrar una cantidad efectiva de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, conjugado a una etiqueta detectable o un agente de imagen.

8. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, como sistema de direccionamiento al nucléolo de una segunda molécula, la cual se encuentra conjugada a dicho péptido.