METODOS Y PRODUCTOS PARA GENOTIPADO IN VITRO.

El método de genotipado se basa en la combinación de un diseño experimental de DNA-chips de genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados por dichos DNA-chips de genotipado basado en el aumento de la señal de hibridación,

lo que garantiza unos elevados niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de los resultados, que permiten que dichos DNA-chips puedan ser utilizados, por ejemplo, como herramientas fiables de diagnóstico genético clínico. De aplicación en el diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante DNA-chips, para la detección de variaciones génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas con enfermedades, o asociadas al genotipado de antíqenos de interés, o asociadas con la resistencia a tratamientos farmacológicos

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200502423.

Solicitante: PROGENIKA BIOPHARMA, S.A..

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: VIZCAYA.

Inventor/es: SIMON BUELA,LAUREANO, MARTINEZ MARTINEZ,ANTONIO, TEJEDOR HERNANDEZ,DIEGO.

Fecha de Solicitud: 5 de Octubre de 2005.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 17 de Septiembre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68B10A
  • G06F19/00C4

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G06F19/00 SECCION G — FISICA.G06 COMPUTO; CALCULO; CONTEO.G06F TRATAMIENTO DE DATOS DIGITALES ELECTRICOS (computadores en los que una parte del cálculo se efectúa hidráulica o neumáticamente G06D, ópticamente G06E; sistemas de computadores basados en modelos de cálculo específicos G06N). › Métodos o equipos para computación digital o procesamiento de datos, especialmente adaptados para aplicaciones específicas (G06F 17/00  tiene preferencia; sistema o métodos de procesamiento de datos especialmente adaptados para propósitos administrativos, comerciales, financieros, de gestión, supervisión o predicción G06Q).

Fragmento de la descripción:

Métodos y productos para genotipado in vitro.

Campo de la invención

La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante DNA-chips, para la detección de variaciones génicas por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas con enfermedades, o asociadas al genotipado de antígenos de interés, o asociadas con la resistencia a tratamientos farmacológicos.

Antecedentes de la invención

DNA-chips

En el año 2001, el Consorcio para el Proyecto Genoma Humano y la empresa privada Celera presentaron un primer borrador completo del genoma humano con 30.000 genes. A partir de este momento se iniciaba la posibilidad del estudio del genoma completo o estudios a gran escala (high-throughput). Los denominados "DNA-chips", también denominados "microarrays", "DNAarrays" o "bio-chips de DNA" son herramientas que la Genómica Funcional puede usar para los estudios a gran escala que se plantean en la actualidad. La Genómica Funcional estudia los cambios en la expresión de los genes debidos al ambiente al que está sometido el individuo y a las características genéticas del mismo. La secuencias de los genes presentan pequeñas variaciones interindividuales de un único nucleótido que reciben el nombre de SNP ("single nucleotide polymorphism") que en un pequeño tanto por ciento están implicados en cambios en la expresión de los genes que causan determinadas patologías. La mayoría de los estudios que aplican DNA-chips son de expresión génica aunque también se utilizan en la detección de SNPs.

El primer DNA-chip fue el "Southern blot" en el que moléculas de ácidos nucleicos marcadas se utilizaban para interrogar moléculas de ácidos nucleicos unidas a un soporte sólido. El soporte sobre el que se llevaba a cabo la interrogación en los primeros DNA-chips eran membranas de nylon. Aunque se partía de una buena idea, la técnica era todavía muy laboriosa.

Dos avances marcaron el arranque definitivo de los DNA-chips. Por una parte, el uso de un soporte sólido no poroso, como el vidrio, que facilitó la miniaturización y la detección basada en fluorescencia. Por otra parte, la adaptación de técnicas fotolitográficas utilizadas en la elaboración de semiconductores para la producción de DNA-chips conteniendo cada uno de ellos más de 400.000 oligonucleótidos distintos, en una región de aproximadamente 20 µm2, los denominados DNA-chips de alta densidad.

Concretamente un DNA-chip es un soporte sólido que contiene cientos de fragmentos de secuencias de genes diferentes representadas en forma de DNA, cDNA u oligonucleótidos inmovilizadas o unidas en su superficie en posiciones fijas. Los soportes son generalmente portaobjetos de vidrio para microscopio, membranas de nylon o "chips" de silicio. Es importante que estas secuencias o sondas estén unidas al soporte en un orden fijo ya que la localización robotizada de cada uno de ellos determina el gen cuya expresión se está midiendo. En función de la tecnología empleada para la producción de los DNA-chips se pueden clasificar en:

- DNA-chips de alta densidad: Los oligonucleótidos que se encuentran en la superficie del portaobjetos de vidrio han sido sintetizados "in situ", mediante una metodología denominada fotolitografía.

- DNA-chips de baja densidad: En este caso los oligonucleótidos, cDNA o fragmentos de PCR son depositados en forma de nanogotas en la superficie del cristal mediante un robot que imprime esas secuencias de DNA en el portaobjetos. Existen pocos ejemplos de DNA-chips de baja densidad y, al contrario que en los de alta densidad, son pocas las variaciones génicas detectadas: un DNA-chip para la detección de 5 mutaciones puntuales en el gen de la tirosinasa, un DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 y k-ras, un DNA-chip para la detección de 12 mutaciones causantes de cardiomiopatía hipertrófica, un DNA-chip para el genotipado de cepas de Escherichia coli o DNA-chips para la detección de patógenos tales como Cryptosporidium parvum o rotavirus.

Según la estrategia de diseño de los oligonucleótidos se puede hablar de:

- "Standard tiling": Se diseñan 4 oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia de referencia excepto en la posición central donde se interrogan las 4 posibilidades: A, C, G y T; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para el genotipado de HIV-1 (Affymetrix). La posición central asegura máxima especificidad.

- "Alternative tiling": En este caso son 5 los oligonucleótidos diseñados, de forma que el quinto interroga una posible deleción en la secuencia; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 (Affymetrix).

- "Block tiling": Se diseñan 4 oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia normal y otros 4 totalmente complementarios a la secuencia mutante; el nucleótido que cambia se coloca en la posición central, pero 2 nucleótidos antes o después se coloca un "missmatch" que puede ser una de las cuatro bases (A, C, T o G).; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para la detección de mutaciones en el citocromo p450 (Affymetrix). Dentro de esta última estrategia ["block tiling"] Affymetrix usa el "missmatch" para aumentar la especificidad de la hibridación no sólo en una posición sino en las posiciones -4, -1, 0, +1 y +4 para identificar el cambio producido en la posición central ó 0. Esta estrategia se denomina "Alternative block tiling" y un claro ejemplo es el DNA-chip para la detección de 1.500 SNPs (Affymetrix).

En el caso de estudios de expresión génica, las sondas depositadas en el vidrio se hibridan con los cDNAs sintetizados a partir de los mRNAs extraídos del tejido que se quiere analizar. Estas moléculas de cDNA han sido marcadas con un fluoróforo al sintetizarse; cuanto mayor sea el número de moléculas que se unen a su secuencia complementaria en el DNA-chip, mayor será la cantidad de fluoróforo que se detecta y mide tras excitarlo con un láser. Esta medida es, por tanto, reflejo del número de moléculas de cada mRNA que había en el tejido analizado y, consecuentemente, reflejo del nivel de expresión de cada gen representado en el DNA-chip, lo que se denomina un patrón de expresión de la célula. Estos DNA-chips de expresión contienen también sondas que representan genes de control ("house-keeping genes"), lo que permite normalizar los resultados y comparar múltiples experimentos de forma cuantitativa. Con un DNA-chip, se pueden determinar en un solo experimento los niveles de expresión de cientos o miles de genes de una célula. El cDNA de la muestra problema y de la muestra control se pueden marcar con dos fluoróforos distintos por lo que en el mismo DNA-chip se pueden estudiar las diferencias entre la expresión de los genes en la muestra control y en la muestra problema.

Los DNA-chips para la detección de polimorfismos genéticos, cambios o mutaciones en general, variaciones génicas, en la secuencia de DNA, comprenden unas superficies sólidas, típicamente de cristal, en las que está depositado un elevado número de secuencias génicas complementarias de cada una de las variaciones génicas que se desea estudiar. Una de las estrategias utilizadas para detectar variaciones génicas consiste en la hibridación de las secuencias que reconocen específicamente al alelo normal y al mutado con fragmentos de DNA procedentes de la muestra que se va a analizar, amplificados mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y marcados con una molécula fluorescente. Al iluminar el DNA-chip con el láser se identifican aquellas secuencias que se han unido a la muestra problema y así se discrimina específicamente un paciente normal de un heterocigoto o un homocigoto mutante. Otra estrategia básica de detección de variaciones génicas con DNA-chips de genotipado consiste en llevar a cabo una reacción de amplificación o extensión sobre el propio DNA-chip.

Dentro de la estrategia de hibridación se puede hacer una subclasificación en función del método de análisis de la información para el genotipado:

- Aumento de la señal de hibridación: Esta estrategia compara la señal de hibridación de las sondas complementarias a los alelos normales y a los alelos mutantes. En general, las muestras mutadas deben presentar una mayor señal de hibridación en las sondas complementarias a los alelos mutantes que en el caso de los individuos normales.

- Pérdida de la señal de hibridación: Los cambios...

 


Reivindicaciones:

1. Un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto, que comprende:

- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;

- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;

- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;

- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;

- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y

- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles.

2. Método según la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico es DNA o RNA.

3. Método según la reivindicación 2, en donde dicho ácido nucleico es RNA o un fragmento del mismo que se utiliza como molde para obtener el correspondiente cDNA.

4. Método según la reivindicación 1, en donde tras la etapa de hibridación se procede a una reacción de amplificación mediante "primer extensión" o a una reacción de ligación mediante un ensayo de ligación de oligonucleótidos ("OLA").

5. Método según la reivindicación 1, en el que cada una de dichas 4 sondas para la detección de cada variación génica presentan la base a interrogar en la posición central y tiene una longitud comprendida entre 19 y 27 nucleótidos.

6. Método según la reivindicación 1, en el que dicho algoritmo es un algoritmo basado en la obtención de tres Funciones Lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles:

AA Función 1 AB Función 2 BB Función 3

en donde

quadAA representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica A; quadAB representa el genotipo de un sujeto heterocigoto para las variación génica A y B; BB representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica B; quadFunción 1 es la Función Lineal que caracteriza a los pacientes con el genotipo AA y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2; quadFunción 2 es la Función Lineal para el genotipo AB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2; quadFunción 3 es la Función Lineal para el genotipo BB y consiste en una: combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2; quaden donde dichas combinaciones lineales están formadas por constantes y cofactores que acompañan a las variables ratio 1 y ratio 2; quadRatio 1 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 2 que detecta la variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:

Ratio 1 = frac{Intensidad media sonda 1}{Intensidad media sonda 1 + Intensidad media sonda 2}

quadRatio 2 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 4 que detecta variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:

Ratio 2 frac{Intensidad media sonda 3}{Intensidad media sonda 3 + Intensidad media sonda 4}

7. Método según la reivindicación 6, en el que el genotipado de dichas variaciones génicas comprende:

- en primer lugar, restar a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas su propio ruido de fondo;

- a continuación, se agrupan las réplicas correspondientes a cada una de las 4 sondas que se han usado para caracterizar cada mutación;

- el valor medio de intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes;

- conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las sondas se calculan los ratios 1 y 2, según las ecuaciones definidas en la reivindicación anterior y dichos ratios se sustituyen en tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles AA, AB y BB definidos en dicha reivindicación anterior; y

- la función que presenta un valor absoluto mayor determina el genotipo que presenta el sujeto en relación con la variación génica analizada.

8. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el que la obtención de dichas funciones lineales se lleva a cabo mediante el análisis de 5 pacientes por cada uno de los tres posibles genotipos de la variación génica AA, AB, BB; con los resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 15 pacientes, los cuales sirven como variables de clasificación de los tres grupos en un análisis discriminante; y, en caso de que la capacidad de discriminación no sea del 100%, los oligonucleótidos son rediseñados.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que los ratios 1 y 2 están dentro del rango de los ratios usados para construir los grupos, la intensidad de fluorescencia media de las 4n réplicas (donde "n" es 6, 8 ó 10) con respecto al ruido de fondo es mayor de 5, determinado mediante el empleo de un escáner de fluorescencia confocal, y el coeficiente de variación de las réplicas está por debajo de 0,25.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que, cuando se utiliza un escáner de fluorescencia confocal:

a) la relación de la intensidad frente al ruido de fondo de todas las sondas depositadas en el soporte está por encima de 15;

b) la media de todos los ratios es superior a 0,6;

c) el coeficiente de variación de todas las réplicas es inferior a 0,25;

d) el ratio del control externo es superior a 0,6; y

e) el control negativo es igual o inferior a 3 veces el ruido de fondo.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el genotipado simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples variaciones génicas humanas asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), o asociadas con antígenos eritrocitarios, o asociadas con reacciones adversas a fármacos.

12. Un DNA-chip de genotipado adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas útiles para detectar variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes, en donde, por cada variación génica a detectar, hay 4 sondas, de las cuales 2 sondas detectan una primera variación génica y las otras 2 detectan una segunda variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas, depositadas siguiendo una patrón determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2 áreas que constituyen el DNA-chip pero no agrupadas por variación génica a detectar, y, opcionalmente, unos oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y negativos de las reacciones de hibridación.

13. Un kit adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende:

- un DNA-chip según cualquiera de la reivindicación 12;

- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende el empleo de un algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente,

- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación del método de la invención.


 

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