Método y dispositivo para la detección de mutaciones en secuencias génicas aisladas del receptor de lipoproteínas de baja densidad (R LDL) asociado con la hipercolesterolemia familiar.

La invención describe métodos extracorpóreos para analizar la presencia o ausencia de mutaciones causantes de hipercolesterolemia familiar.

Los métodos indican la forma de detectar estas mutaciones a partir de una muestra de ADN de un individuo y utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores complementarios al gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad, el análisis del producto amplificado por secuenciación, análisis de restricción, técnicas de los polimorfismos de conformación de cadena sencilla, análisis de heterodúplex y de un dispositivo sobre un soporte de vidrio "biochip" en el que se depositan sondas de oligonucleótidos que permite detectar estas mutaciones en el ADN.

Método y dispositivo para la detección de mutaciones en secuencias génicas aisladas del receptor de lipoproteínas de baja densidad (R-LDL) asociado con la hipercolesterolemia familiar.

Sector de la invención La presente invención se refiere a un método “in vitro” para detectar individuos que están predispuestos a la enfermedad llamada hipercolesterolemia familiar y, más particularmente, a un método para detectar la presencia o ausencia de la mutación [313+1 inst en el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1] asociada con hipercolesterolemia familiar.

Antecedentes de la invención La aterosclerosis se define, según la Organización Mundial de la Salud (OMS) , como una combinación variable de cambios que se produce en la íntima de las arterias que implica la acumulación focal de lípidos y compuestos complejos con sangre y sus constituyentes, que se acompaña con la formación de tejido fibroso, calcificación y cambios asociados en la media.

La aterosclerosis puede considerarse como una forma especial de arteriosclerosis con un depósito patógeno significativo de lípidos en la pared arterial. La mayoría de formas de la arteriosclerosis implican la degeneración grasa de la pared vascular, los términos “arteriosclerosis” y “aterosclerosis” pueden utilizarse de forma indistinta (Assmann G. en “Lipid Metabolism and Atherosclerosis” Schattauer Verlag GMbH, Stuttgart 1982:1) .

Los lípidos son casi completamente insolubles en soluciones acuosas. Las lipoproteínas representan la unidad funcional del transporte de lípidos insolubles en agua en la sangre. Las lipoproteínas se dividen en diversas categorías según su densidad, tal como se determina por ultracentrifugación. (Havel RJ y otros J Clin Invest 1955,

34: 1345) . Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (d=1, 019-1, 063 g/ml) transportan la mayor parte del colesterol en la sangre. Éstas están compuestas por aproximadamente el 75% de lípidos (principalmente colesterol, ésteres de colesterol y fosfolípidos) y el 25% de proteínas. Aproximadamente el 70% del colesterol total de la sangre es transportado por las partículas LDL.

La hipercolesterolemia (es decir, la elevación del colesterol de lipoproteínas de baja densidad en plasma (c-LDL) es uno de los factores de riesgo más críticos para el inicio y progresión de la arteriosclerosis. Más de la mitad de todas las muertes en la sociedad occidental están relacionadas con enfermedades cardiovasculares ateroscleróticas (Murray CJL y López AD. Lancet 1997; 349: 1269-1276) .

Las hipercolesterolemia familiar (HF: MIM#143890) es una enfermedad hereditaria autosómica codominante del metabolismo de lipoproteínas causada por mutaciones que se producen en el gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (r-LDL) , una proteína de la superficie celular que media en la captación y degradación específica de las LDL plasmáticas (Goldstein JL, Brown MS Ann Rev Cell Biol 1985; 1: 1 -39) . La penetrancia de la HF es cercana al 100% lo que significa que la mitad de la descendencia de un progenitor afectado tendrá un nivel de colesterol plasmático muy elevado desde el momento de nacer, afectando por igual a hombres y mujeres (Goldstein JL, Brown MS. The metabolic basis of inherited disease. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D. McGraw Hill Nueva York 6ª edición, 1989; 1215-1250) . Los individuos afectados por HF presentan arco lipoideo corneal, xantomas tendinosos y cardiopatía coronaria sintomática prematura (Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142: 105-115) . La HF es uno de los trastornos hereditarios más frecuentes con frecuencias estimadas de heterocigotos y homocigotos de 1/500 y 1/1.000.000, respectivamente.

En algunas poblaciones predominan un pequeño número de mutaciones debido a efectos fundadores y, por lo tanto, la frecuencia de heterocigóticos para HF es mayor, estas poblaciones incluyen los canadienses de habla francesa (Leitersdorf E y otros J Clin Invest 1990; 85:1014-1023) , cristianos libaneses (Lehrman MA y otros J Biol Chem 1987; 262:401-410) , drusos (Landsberger D y otros Am J Hum Genet 1992; 50: 427-433) finlandeses (Koivisto UM y otros J Clin Invest 1992; 90: 219-228) , los “Afrikaners” de Sudáfrica (Kotze MJ y otros Ann Hum Genet 1991; 55: 115-121) y los judíos Ashkenazi de descendencia lituana (Meiner V y otros Am J Hum Genet 1991; 49:443-449) .

Los pacientes heterocigóticos para HF presentan un incremento de dos veces del colesterol en plasma, (por regla general superior al valor del percentil 95 para la población) . La mortalidad de los pacientes con HF, ajustada por edad y sexo, es entre cuatro y cinco veces más alta que en la población general (Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142: 105-115) . Los pacientes que heredan dos mutaciones en el locus del gen del r-LDL se denominan “homocigóticos para HF” o “heterocigóticos compuestos para HF”. Poco o ningún r-LDL funcional se sintetiza en dichos individuos. Estas anomalías conducen a una elevación de los niveles de c-LDL en plasma de entre seis y ocho veces ya en la gestación intrauterina, como consecuencia, la cardiopatía coronaria habitualmente aparece antes de los 20 años (Goldstein JL y otros N Engl J Med 1983; 309: 288-296) . Si los individuos con HF heterocigótica u homocigótica pudieran ser diagnosticados antes

de desarrollar la enfermedad sintomática, podrían ser tratados de forma preventiva para reducir su riesgo de infarto de miocardio.

El r-LDL es una glucoproteína ubicua transmembrana de 839 aminoácidos que media en el transporte de LDL al interior de las células por endocitosis (Goldstein J. y Brown M. J Biol Chem 1974; 249:5153-5162) (figura 1) .

El gen del r-LDL se encuentra situado en el brazo corto del cromosoma 19pl3.1-13.3 (Yamamoto T y otros Cell 1984;

39: 27-38) , tiene un tamaño de 45.000 pares de bases (pb) . Éste contiene 18 exones y 17 intrones los cuales codifican los seis dominios funcionales de la proteína madura: el péptido señal, el dominio de unión del ligando, el dominio homólogo al factor de crecimiento epidérmico (EGF) , azúcar con enlaces O-glucosídicos, el dominio transmembrana y el citoplásmico (Sundhof T y otros Science 1985; 228: 893-895) (figura 2) .

La producción de r-LDL se encuentra regulada estrechamente por un sofisticado mecanismo de retroalimentación que controla la transcripción del gen del r-LDL en respuesta a variaciones de la concentración intracelular de esteroles y la demanda celular de colesterol (Sudhof TC y otros J Biol Chem 1987; 262: 10773-10779) . Los motivos de ADN necesarios para la regulación de la transcripción del gen del r-LDL están situadas en una región de 177 pb del promotor proximal (Sudhof TC y otros J Biol Chem 1987; 262: 10773-10779) . Esta región contiene todos los elementos en cis para la expresión basal y la regulación de esteroles e incluye tres repeticiones directas imperfectas de 16 pb cada una, las repeticiones 1 a 3. La repetición 1 y la 3 contienen sitios de unión para el factor de transcripción Sp1 y contribuyen a la expresión basal del gen, pero requieren la contribución de la repetición 2 para una expresión fuerte (Dawson PA y otros J Biol Chem 1988; 263; 3372-3379) . La repetición 2 contiene un elemento regulador de 10 pb, SRE-1 (Smith JR y otros J Biol Chem 1990; 265: 2306-2310) que potencia la transcripción cuando la concentración de esteroles intracelulares es baja mediante interacción con un factor de transcripción denominado SREBP-1. Hasta la fecha, se han cartografiado varias mutaciones de origen natural en los elementos reguladores de la transcripción del gen del r-LDL (Hobbs HH, y otros Hum Mutat 1992; 1: 445-466; Koivisto UM, y otros Proc Natl Acad Sci Estados Unidos, 1994; 91: 10526-10530) , Mozas P, y otros J Lipid Res 2002; 43: 13-18, http.//www.ucl.ac.uk/fh; http.//www.umd.necker.fr) .

El exón 1 codifica el péptido señal; una secuencia hidrófoba de 21 aminoácidos. Este péptido es escindido de la proteína durante la translocación que tiene lugar en el retículo endoplasmático. Se han descrito varias mutaciones por cambio de marco, sin sentido y antisentido en este exón (http.//www.ucl.ac.uk/fh; http.//www.umd.necker.fr) .

Los exones 2 a 6 codifican el dominio de unión al ligando, el cual consta de siete repeticiones en tándem de 40 aminoácidos cada una. La estructura del dominio de unión al ligando ha sido esclarecida de forma parcial (Jeon H y otros Nature Struc Biol 2001; 8: 499-5049) . En cada repetición hay una agrupación de aminoácidos cargados negativamente Asp-X-Ser-Asp-Glu y seis... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para diagnosticar hipercolesterolemia familiar que comprende detectar, como mínimo, la mutación 313+1insT en el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1, a partir de una muestra biológica de un individuo.

2. Método, según la reivindicación 1, que comprende además la detección de la mutación 313+1G>C.

3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además la detección de la mutación Q71 E.

4. Método, según la reivindicación 1, que comprende además detectar una mutación seleccionada entre: (-23) A>C, 1054 del11, 108delC, 1197del9, 1207de1T, 1432delG.

19. 2delAinsCT, 2184delG, 231delC, 2399de15ins4, 338dell6, 509insC, 675dell5, 684dup12.

94. 39C>T, C195R, C255G, C319Y, D157G, D630N, E291X, H635N, N59K, T41M, W515X, Y379X, Y421X, T433N, 818de18, 1423delGC/insA, 1204insT, 451de13, G516X, 2389+4A>G, 1815del11, 1186+5G>A, T740M, I771T, R279G, T446I, H562Q, C74Y, D686Y, G (-2) R, E579D, S205C, D200V, V766E, L (-6) P, 2544insC, C42Y, 2389+3A>C, [1587-5de15;1587de131].

5. Método, según la reivindicación 1, que comprende hibridar los oligonucleótidos que tienen las secuencias SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59 con el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1, a partir de una muestra biológica de un individuo.

6. Método, según la reivindicación 1, que comprende detectar un grupo de mutaciones que comprende: 313+linsT, 313+1G>C y Q71E en el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1, a partir de una muestra biológica de un individuo.

7. Kit para diagnosticar hipercolesterolemia familiar en una muestra biológica de un individuo, que comprende los oligonucleótidos que tienen las secuencias: SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59 que hibridan con el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1.