Un procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de segmento de ácido nucleico desconocido o para distinguir dos secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas,

comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, comprendiendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción superior al de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de la luz; y (iii) una superficie reactiva que comprende una pluralidad de sitios que tienen oligonucleótido inmovilizado sobre la misma, definiendo dichos sitios una matriz de oligonucleótidos que tiene diferentes secuencias para hibridarse con el ácido nucleico desconocido, no teniendo otras porciones de no sitio de la superficie de dicho elemento oligonucleótidos inmovilizados sobres la mismas; (b) poner en contacto la superficie reactiva bajo condiciones de hibridación con dicho ácido nucleico desconocido en el que dicho ácido nucleico desconocido, tanto directamente como mediante pares de unión análogos intermedios si se desea, está marcado con una marca difusora de la luz; formándose así complejos de marca difusora de la luz unidos a aquellos sitios de la superficie reactiva que son complementarios a la secuencia del ácido nucleico desconocido; (c) iluminar el borde receptor de la luz de la guía de ondas con luz eficaz para crear reflexión interna total dentro de la guía de ondas, iluminándose así simultáneamente toda la superficie reactiva; (d) recoger sustancialmente simultáneamente la luz difundida, si la hay, de cada sitio y de porciones de no sitio de dicha superficie; (e) comparar el grado de difusión de la luz en cada sitio con tanto (i) el grado de difusión de la luz en una porción de no sitio; como (ii) el grado de difusión de la luz en otro sitio; y (f) que comprende además aumentar incrementalmente las condiciones de rigurosidad en la superficie reactiva del dispositivo de guía de ondas parar iniciar la disociación de ácido nucleico unido de los sitios y repetir las etapas (d) y (e) en cada incremento; por lo que diferencias de un único par de bases entre los oligonucleótidos y el ácido nucleico desconocido pueden distinguirse de apareamientos perfectos por diferencias en las propiedades de disociación

Campo de la invención

La invención se refiere a varios campos, especialmente a interacciones de componentes de unión específica, guías de ondas evanescentes y a la difusión de la luz. Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento de detección de uno o más analitos de unión específica, especialmente ADN u oligonucleótidos, mediante técnicas de difusión de la luz, produciéndose la difusión por una marca particulada mantenida mediante fuerzas de unión específica dentro de la profundidad de penetración de la onda evanescente de una guía de ondas.

Antecedentes de la invención

La reflexión interna total (“TIR”) se conoce en la técnica y se describe con referencia a la Figura 1. La TIR funciona según el principio de que la luz 10 que se desplaza en un medio 12 más denso (es decir, que tiene el mayor índice de refracción, N1) y choca con la superficie 14 de separación entre el medio más denso y un medio 16 más raro (es decir, que tiene el menor índice de refracción, N2) es totalmente reflejada dentro del medio 12 más denso si choca contra la superficie de separación con un ángulo, R, mayor que el ángulo crítico, C, definiéndose el ángulo crítico por la ecuación:

 arcsen(N /N )

c 21

Bajo estas condiciones se genera una forma de onda electromagnética conocida como “onda evanescente”. Como se muestra en la Figura 1B, el campo eléctrico asociado a la luz en el medio más denso forma una onda 18 sinusoidal permanente normal a la superficie de separación. La onda evanescente penetra en el medio 16 más raro, pero su energía E se disipa exponencialmente en función de la distancia Z desde la superficie de separación como se muestra en 20. Un parámetro conocido como “profundidad de penetración” (dP - mostrado en la Figura 1A a 22) se define como la distancia desde la superficie de separación en la que la energía de la onda evanescente ha disminuido hasta 0,368 veces el valor de la energía en la superficie de separación. [Véase. Sutherland y col., J. Immunol. Meth., 74:253-265 (1984) que define dp como la profundidad en la que E= (e-1).E0. La profundidad de penetración se calcula del siguiente modo:

 /N

dP  1 22 1/2

2sen  (N /N)

R 21

Los factores que tienden a aumentar la profundidad de penetración son: aumento del ángulo de incidencia, R; índices de refracción estrechamente igualados de los dos medios (es decir, N2/N1 -> 1); y aumento de la longitud de onda, . Por ejemplo, si un elemento de TIR de cuarzo (N1 = 1,46) se coloca en un medio acuoso (N2 = 1,34), el ángulo crítico, C, es 66° (= arcsen 0,9178). Si luz de 500 nm impacta contra la superficie de separación a R = 70° (es decir, mayor que el ángulo crítico), la dp es aproximadamente 270 nm.

Dentro de la profundidad de penetración, la onda evanescente en el medio más raro (normalmente una disolución de reacción) puede excitar fluorescencia en la muestra. Este fenómeno se ha usado en la materia con respecto a inmunoensayos Harrick y col., Anal. Chem., 45:687 (1973). Los dispositivos y procedimientos que usan fluorescencia de TIR para inmunoensayos se han descrito en la materia por Hirschfield, patentes de EE.UU. 4.447.564, 4.577.109 y 4.654.532; Hirschfield y Block, patentes de EE.UU. nº 4.716.121 y 4.582.809 y documento de EE.UU. nº de serie 07/863.553 publicado como el documento WO 93/20240 (Abbott Labs), que se incorporan todos en este documento por referencia. Un agente inmunoespecífico se adhiere a la superficie del elemento y deja que reaccione con componentes de unión específica fluorescentemente marcados en el medio más raro. La unión específica hace que las marcas fluorescentes se unan dentro de la profundidad de penetración. La fluorescencia emitida (a la longitud de onda desplazada) hace un túnel en el elemento de TIR, se propaga dentro del elemento de TIR a lo largo de la misma trayectoria que la onda sinusoidal permanente (pero a una longitud de onda diferente) y se detecta a la salida del elemento.

La TIR también se ha usado conjuntamente con la detección de la difusión de la luz en una técnica denominada en lo sucesivo reflectancia interna total difundida (“STIR”). Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU.

4.979.821 y 5.017.009 a Schutt y col. y el documento WO 94/00763 (Akzo N. V.). Según esta técnica, un haz de luz es barrido a través de la superficie de un elemento de TIR a un ángulo adecuado y la energía de la luz es totalmente reflejada, excepto la onda evanescente. Partículas tales como glóbulos rojos sanguíneos, oro coloidal o látex específicamente unidos dentro de la profundidad de penetración difundirán la luz y la luz difundida se detecta por un medio de fotodetección. El documento WO 94/00763 también describe el barrido del haz de luz a través de varios sitios de miembros de unión específica que son tanto (1) el mismo miembro de unión a concentración variable para lograr un intervalo dinámico más ancho o (2) diferentes miembros de unión para probar diferentes analitos en una forma múltiplex. El barrido del haz de luz a través de múltiples sitios y la recogida de luz difundida en cada uno es un procedimiento que requiere mucho tiempo.

En la patente de EE.UU. 4.608.344 a Carter y col. una guía de ondas óptica se emplea como elemento de TIR. En una variación, múltiples sitios de unión están dispuestos sobre la guía de ondas en líneas o rejillas específicas para crear un patrón de rejilla de difracción de luz difundida. Mirando luego en sólo órdenes específicos de luz difundida, esta técnica minimiza la difusión producida por imperfecciones superficiales y/o impurezas tales como partículas de polvo (véanse la Fig. 14 y las columnas 17-19).

El uso práctico de los dispositivos de Carter y de STIR está muy limitado por la grave difusión de ruido de partículas en disolución. Este ruido limita la sensibilidad de detección de partículas unidas asociadas al analito. El escaso rendimiento se compensó con la sofisticada electrónica y óptica que podrían discriminar la pequeña cantidad de señal con respecto a los altos niveles de ruido. La complejidad electrónica y óptica produce sistemas muy caros.

Finalmente, la patente de EE.UU. 5.192.502 a Attridge y col. enseña un dispositivo que comprende placas paralelas que definen una cavidad para recibir un fluido de muestra. Una placa sirve de guía de ondas y la otra está recubierta de una capa de un material absorbente de la luz.

Otra técnica anterior de interés incluye la divulgación de Drmanac y col., patente de EE.UU. 5.202.231, que describe una nueva técnica para la generación de información de secuencias de ácidos nucleicos conocida como secuenciación por hibridación (SBH). Según esta técnica, una fase sólida que contiene unida a la misma una matriz de oligonucleótidos de secuencia conocida se deja hibridar con ADN marcado de una muestra. Por tanto, un único experimento de hibridación permite el examen de un gran número de sitios diferentes sobre una molécula de ADN. El diagnóstico de varias afecciones genéticas humanas tales como distrofia muscular de Duchenne o fibrosis quística probablemente requerirá el poder de resolución de un sistema del tipo SBH para determinar la mutación asociada al estado de enfermedad de un modo preciso y económico. Una implementación particular del procedimiento de SBH usa un gran número de oligonucleótidos inmovilizados en una matriz bidimensional de alta densidad. Un dispositivo tal se ha llamado un “chip de ADN” análogo a los circuitos de alta densidad producidos por la industria electrónica. Una muestra de ADN desconocido se aplica al chip y el patrón de hibridación se determina y se analiza para obtener información de las secuencias. Los documentos WO 92/10588 y WO 92/10092 (Affymax Technologies N.V.) contienen divulgaciones similares, además de un procedimiento fotolitográfico para fabricar tales chips.

Como las condiciones de rigurosidad afectan a la hibridación, la perfecta diferenciación y la especificidad pueden obtenerse si la rigurosidad puede controlarse con exactitud. Por tanto, las curvas de fusión podrían proporcionar una dimensión adicional al sistema de chip de ADN y permitir una mejor diferenciación de secuencias estrechamente relacionadas, una preocupación en la implementación de tecnología de SBH. La capacidad para cambiar la temperatura... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de segmento de ácido nucleico desconocido

o para distinguir dos secuencias de nucleótidos estrechamente relacionadas, comprendiendo el procedimiento:

(a) proporcionar un dispositivo de guía de ondas, comprendiendo el dispositivo de guía de ondas (i) un elemento transparente que tiene un índice de refracción superior al de la muestra de fluido; (ii) un borde receptor de la luz; y (iii) una superficie reactiva que comprende una pluralidad de sitios que tienen oligonucleótido inmovilizado sobre la misma, definiendo dichos sitios una matriz de oligonucleótidos que tiene diferentes secuencias para hibridarse con el ácido nucleico desconocido, no teniendo otras porciones de no sitio de la superficie de dicho elemento oligonucleótidos inmovilizados sobres la mismas;

(b) poner en contacto la superficie reactiva bajo condiciones de hibridación con dicho ácido nucleico desconocido en el que dicho ácido nucleico desconocido, tanto directamente como mediante pares de unión análogos intermedios si se desea, está marcado con una marca difusora de la luz; formándose así complejos de marca difusora de la luz unidos a aquellos sitios de la superficie reactiva que son complementarios a la secuencia del ácido nucleico desconocido;

(c) iluminar el borde receptor de la luz de la guía de ondas con luz eficaz para crear reflexión interna total dentro de la guía de ondas, iluminándose así simultáneamente toda la superficie reactiva;

(d) recoger sustancialmente simultáneamente la luz difundida, si la hay, de cada sitio y de porciones de no sitio de dicha superficie;

(e) comparar el grado de difusión de la luz en cada sitio con tanto (i) el grado de difusión de la luz en una porción de no sitio; como (ii) el grado de difusión de la luz en otro sitio; y

(f) que comprende además aumentar incrementalmente las condiciones de rigurosidad en la superficie reactiva del dispositivo de guía de ondas parar iniciar la disociación de ácido nucleico unido de los sitios y repetir las etapas (d) y (e) en cada incremento;

por lo que diferencias de un único par de bases entre los oligonucleótidos y el ácido nucleico desconocido pueden distinguirse de apareamientos perfectos por diferencias en las propiedades de disociación.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ácidos nucleicos del analito incluye un indicador de haptenos y el miembro de unión específica unido a dicha marca difusora de la luz es específico para dicho indicador de haptenos.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho procedimiento comprende además un segundo elemento transparente conectado a dicho primer elemento para formar un canal capilar bidimensional entre ellos de forma que la superficie reactiva se forme en el canal.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha marca difusora de la luz es una partícula seleccionada del grupo que consiste en oro coloidal, selenio coloidal y látex.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la recogida sustancialmente simultánea de luz difundida de una pluralidad de sitios se lleva a cabo visualmente por el ojo y el cerebro de un observador.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la recogida sustancialmente simultánea de luz difundida se lleva a cabo por una matriz de dispositivos fotodetectores seleccionados del grupo que consiste en fotodiodos, dispositivos de carga acoplada, fototransistores, fotorresistores y fotomultiplicadores.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha marca difusora de la luz está unida a dicho primer miembro de unión específica de un segundo par de unión análogo mediante un par de unión análogo intermedio seleccionado del grupo que consiste en: hapteno y anticuerpo dirigido contra hapteno; biotina y avidina o estreptavidina; y secuencias de ácidos nucleicos complementarios.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las condiciones de rigurosidad se aumentan incrementalmente mediante aumentos escalonados de temperatura.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las condiciones de rigurosidad se aumentan incrementalmente mediante aumentos escalonados de un agente de dilución que disminuye la fuerza iónica de la disolución.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho dispositivo de guía de ondas está provisto de una superficie de reacción que tiene un recubrimiento de proteína metasoluble.