APARATO Y PROCEDIMIENTO PARA LA SECUENCIACION DE ACIDOS NUCLEICOS.

Matriz para secuenciar un ácido nucleico, que comprende: una oblea cavitada de fibras ópticas formadas a partir de un haz de una pluralidad de fibras ópticas individuales,

presentando cada fibra óptica individual un diámetro de entre 3 y 100 µm, comprendiendo la oblea una superficie superior y una superficie inferior, comprendiendo la superficie superior más de 400.000 cámaras de reacción, en la que las cámaras de reacción se encuentran grabadas en la superficie superior de la oblea cavitada de fibras ópticas y en el que el grosor de la oblea entre la superficie superior y la superficie inferior presenta un grosor de entre 0,5 mm y 5,0 mm; en el que la profundidad de cada cámara de reacción se encuentra comprendida entre una mitad del diámetro de la fibra óptica individual y tres veces el diámetro de la fibra óptica individual, y en el que una pluralidad de cámaras de reacción sobre la superficie superior de la oblea cavitada presenta un ácido nucleico en las mismas, y en el que 50% a 100% de las cámaras de reacción puede presentar un soporte sólido móvil con un enzima de secuenciación inmovilizado sobre el mismo

CAMPO TÉCNICO [0001] La invención se refiere a un aparato y a métodos para determinar la secuencia de un ácido nucleico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN [0002] Muchas enfermedades se asocian a secuencias particulares de ADN. Las secuencias de ADN con frecuencia se denominan polimorfismos de secuencia de ADN para indicar que la secuencia de ADN asociada a un estado de enfermedad difiere de la secuencia de ADN correspondiente en individuos no afectados. Entre los polimorfismos de secuencia de ADN se incluyen, por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en una secuencia respecto a una segunda secuencia. Un ejemplo de un polimorfismo de secuencia de ADN particular es 5'-ATGC-3' respecto a la secuencia 5'-ATGG-3' en una localización particular en el genoma humano. El primer nucleótido 'G' en la última secuencia ha sido sustituido por el nucleótido 'C' en la primera secuencia. La primera secuencia se asocia a un estado de enfermedad particular, mientras que la última secuencia se encuentra en individuos que no padecen la enfermedad. De esta manera, la presencia de la secuencia de nucleótidos 5'-ATCG-3' indica que el individuo presenta una enfermedad particular. Este tipo particular de polimorfismo de secuencia es conocido como polimorfismo de nucleótido único,

o SNP, debido a que la diferencia entre las secuencias se debe a un cambio de un único nucleótido. [0003] Las técnicas que permiten la rápida detección de tan sólo un único cambio de base de ADN resultan, por lo tanto, metodologías importantes para la utilización en el análisis genético. Debido al gran tamaño del genoma humano, del orden de 3.000 millones de pares de bases, las técnicas para identificar polimorfismos deben ser suficientemente sensibles para identificar específicamente la secuencia que contiene el polimorfismo en una población potencialmente grande de ácidos nucleicos. [0004] Típicamente, se lleva a cabo un análisis de polimorfismo de secuencias del ADN mediante el aislamiento del ADN de un individuo, la manipulación del ADN aislado, por ejemplo mediante digestión del ADN con enzimas de restricción y/o la amplificación de un subconjunto de secuencias en el ADN aislado. A continuación, se examina adicionalmente el ADN manipulado para determinar si se encuentra presente una secuencia particular. [0005] Entre los procedimientos utilizados comúnmente para analizar el ADN se incluyen la electroforesis. Entre las aplicaciones comunes de la electroforesis se incluyen la electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida. Las secuencias de ADN se insertan, o se cargan, en los geles y se someten a un campo eléctrico. Debido a que el ADN porta una carga negativa uniforme, el ADN migra a través del gel basado en propiedades que incluyen la longitud de la secuencia, la conformación tridimensional e interacciones con la matriz de gel tras la aplicación del campo eléctrico. En la mayoría de aplicaciones, las moléculas de ADN más pequeñas migrarán más rápidamente a través del gel que los fragmentos más grandes. Tras prolongar la electroforesis durante un periodo de tiempo suficientemente largo, las moléculas de ADN en la población inicial de secuencias de ADN se habrán separado según sus tamaños relativos. [0006] De esta manera pueden detectarse moléculas particulares de ADN utilizando una diversidad de metodologías de detección. Para algunas aplicaciones, se identifican secuencias particulares de ADN a partir de la presencia de etiquetas detectables, tales como marcajes radioactivos, unidos a molécula de ADN específicas. [0007] Los análisis de separación de tipo electroforético pueden resultar menos deseables para aplicaciones en las que resulta deseable analizar rápida, económica y exactamente un gran número de muestras de ácidos nucleicos para polimorfismos de secuencia particulares. Por ejemplo, el análisis de tipo electroforético puede requerir una gran cantidad de ADN de entrada. Además, el procesamiento de un gran número de muestras, requerido para los análisis de ácidos nucleicos basados en la electroforesis, puede ser laboriosa. Además, estas técnicas pueden requerir muestras de moléculas de ADN idénticas, que deben crearse antes de la electroforesis a costes que pueden ser considerables. [0008] Recientemente se han puesto a disposición del público sistemas automáticos de electroforesis. Sin embargo, la electroforesis puede resultar poco adecuada para aplicaciones tales como la secuenciación clínica, en la que resultan necesarias unidades relativamente rentables de alto rendimiento. De esta manera, la necesidad de métodos no electroforéticos para la secuenciación es grande. Para muchas aplicaciones, se utiliza la electroforesis conjuntamente con el análisis de secuencias de ADN. [0009] Se han descrito varias alternativas a la secuenciación de tipo electroforético. Entre ellas se incluyen la microscopía electrónica de barrido de efecto túnel, la secuenciación mediante hibridación y los métodos de detección de moléculas individuales. [0010] Otra alternativa al análisis de separación de tipo electroforético son los análisis de ácidos nucleicos basados en un sustrato sólido. Estos sustratos típicamente se basan en la utilización de grandes números de sondas de ácidos nucleicos fijados en diferentes localizaciones en un soporte sólido. Entre estos soportes sólidos se incluyen, por ejemplo, superficies de vidrio, placas de microtitulación de plástico, hojas de plástico, polímeros delgados o semiconductores. [0011] Las sondas pueden, por ejemplo, adsorberse o unirse covalentemente al soporte, o pueden microencapsularse o de otro modo atraparse dentro de una matriz de sustrato, membrana o película.

Entre los análisis de ácidos nucleicos basados en un sustrato pueden incluirse aplicar un ácido nucleico de muestra que se conoce o se sospecha que contiene un polimorfismo de secuencia particular a una matriz o a sondas unidas al sustrato sólido. Los ácidos nucleicos en la población se dejan hibridar a secuencias complementarias unidas al sustrato, en caso de encontrarse presente. A continuación, se detectan las secuencias de ácidos nucleicos hibridantes en una etapa de detección. [0013] Las metodologías de hibridación basadas en una matriz de soporte sólido y de secuenciación pueden requerir una concentración elevada de ADN de muestra y pueden resultar afectadas negativamente por la cinética relativamente lenta de la hibridación de las muestras de ácidos nucleicos con las sondas oligonucleótidas inmovilizadas. Con frecuencia, únicamente se dispone de una cantidad reducida de ADN de molde, y puede resultar deseable disponer de concentraciones elevadas de la secuencia diana de ácidos nucleicos. De esta manera, los análisis de detección basados en un sustrato con frecuencia incluyen una etapa en la que se amplifican copias del ácido nucleico diana, o un subconjunto de secuencias en el ácido nucleico diana. Los métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, pueden incrementar un número pequeño de sondas diana en varios órdenes de magnitud en solución. Sin embargo, la PCR puede reusltar difícil de incorporar en un enfoque de fase sólida debido a que el ADN amplificado no se encuentra inmovilizado sobre la superficie de la matriz de soporte sólido. [0014] La detección basada en una fase sólida de los polimorfismos de secuencia ha sido descrita. Un ejemplo es un protocolo de "mini-secuenciación" basado en un principio de fase sólida descrito por Hultman et al., Nucl. Acids Res. 17:4937-4946, 1988; Syvanen et al., Genomics 8:684-692, 1990. En este estudio, la incorporación de un nucleótido marcado radioactivamente se mide y se utiliza para el análisis de un polimorfismo de tres alelos del gen de la apolipoproteína E humana. Sin embargo, dichos métodos radioactivos no resultan muy adecuados para las aplicaciones clínicas rutinarias, y por lo tanto, el desarrollo de un método no radioactivo simple y altamente sensible para el análisis rápido de la secuencia del ADN también ha despertado un gran interés. [0015] Walt D. et al., Anal. Chem. 72:5618-5624, 2000, dan a conocer una matriz aleatoria de microesferas de ADN de fibra óptica de alta densidad. [0016] Walt D. et al., Anal. Chem. 70:1242-1248, 1998, dan a conocer matrices detectoras ópticas direccionables de alta densidad ordenadas aleatoriamente. [0017] Winograd N. et al., Anal. Chem. 71:3318-3324, 1999, dan a conocer matrices con

10.000 nanoviales/cm2. [0018] Walt D. et al., Nature Biotech. 14:1681-1684, 1996, dan a conocer una micromatriz biodetectora de ADN de fibra óptica para el análisis de la expresión génica. [0019] La patente WO nº 97/27326 da a conocer un método de fabricación y lectura de una