METODOS Y PRODUCTOS PARA GENOTIPADO IN VITRO DE VARIACIONES GENICAS HUMANAS ASOCIADAS A ANTIGENOS ERITROCITARIOS HUMANOS.

Métodos y productos para genotipado in vitro de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos.



El método de genotipado se basa en la combinación de un diseño experimental de DNA-chips de genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados por dichos DNA-chips de genotipado basado en el aumento de la señal de hibridación, lo que garantiza unos elevados niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de los resultados, que permiten que dichos DNA-chips puedan ser utilizados como herramientas fiables de diagnóstico genético clínico; en particular, en la detección de variaciones génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas al genotipado de antígenos eritrocitarios humanos de interés.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901845.

Solicitante: PROGENIKA BIOPHARMA, S.A..

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: SIMON BUELA,LAUREANO, MARTINEZ MARTINEZ,ANTONIO, TEJEDOR HERNANDEZ,DIEGO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

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Fragmento de la descripción:

Métodos y productos para genotipado in vitro de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos.

Campo de la invención La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante DNA-chips, para la detección de variaciones génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas al genotipado de antígenos eritrocitarios.

Antecedentes de la invención DNA-chips En el año 2001, el Consorcio para el Proyecto Genoma Humano y la empresa privada Celera presentaron un primer borrador completo del genoma humano con 30.000 genes. A partir de este momento se iniciaba la posibilidad del estudio del genoma completo o estudios a gran escala (high-throughput) . Los denominados "DNA-chips", también denominados "microarrays", "DNAarrays" o "bio-chips de DNA" son herramientas que la Genómica Funcional puede usar para los estudios a gran escala que se plantean en la actualidad. La Genómica Funcional estudia los cambios en la expresión de los genes debidos al ambiente al que está sometido el individuo y a las características genéticas del mismo. La secuencias de los genes presentan pequeñas variaciones interindividuales de un único nucleótido que reciben el nombre de SNP ("single nucleotide polymorphism") que en un pequeño tanto por ciento están implicados en cambios en la expresión de los genes que causan determinadas patologías. La mayoría de los estudios que aplican DNA-chips son de expresión génica aunque también se utilizan en la detección de SNPs.

El primer DNA-chip fue el "Southern blot" en el que moléculas de ácidos nucleicos marcadas se utilizaban para interrogar moléculas de ácidos nucleicos unidas a un soporte sólido. El soporte sobre el que se llevaba a cabo la interrogación en los primeros DNA-chips eran membranas de nylon. Aunque se partía de una buena idea, la técnica era todavía muy laboriosa.

Dos avances marcaron el arranque definitivo de los DNA-chips. Por una parte, el uso de un soporte sólido no poroso, como el vidrio, que facilitó la miniaturización y la detección basada en fluorescencia. Por otra parte, la adaptación de técnicas fotolitográficas utilizadas en la elaboración de semiconductores para la producción de DNA-chips conteniendo cada uno de ellos más de 400.000 oligonucleótidos distintos, en una región de aproximadamente 20 μm2, los denominados DNA-chips de alta densidad.

Concretamente un DNA-chip es un soporte sólido que contiene cientos de fragmentos de secuencias de genes diferentes representadas en forma de DNA, cDNA u oligonucleótidos inmovilizadas o unidas en su superficie en posiciones fijas. Los soportes son generalmente portaobjetos de vidrio para microscopio, membranas de nylon o "chips" de silicio. Es importante que estas secuencias o sondas estén unidas al soporte en un orden fijo ya que la localización robotizada de cada uno de ellos determina el gen cuya expresión se está midiendo. En función de la tecnología empleada para la producción de los DNA-chips se pueden clasificar en:

- DNA-chips de alta densidad: Los oligonucleótidos que se encuentran en la superficie del portaobjetos de vidrio han sido sintetizados "in situ", mediante una metodología denominada fotolitografía.

- DNA-chips de baja densidad: En este caso los oligonucleótidos, cDNA o fragmentos de PCR son depositados en forma de nanogotas en la superficie del cristal mediante un robot que imprime esas secuencias de DNA en el portaobjetos. Existen pocos ejemplos de DNA-chips de baja densidad y, al contrario que en los de alta densidad, son pocas las variaciones génicas detectadas: un DNA-chip para la detección de 5 mutaciones puntuales en el gen de la tirosinasa, un DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 y k-ras, un DNA-chip para la detección de 12 mutaciones causantes de cardiomiopatía hipertrófica, un DNA-chip para el genotipado de cepas de Escherichia coli o DNA-chips para la detección de patógenos tales como Cr y ptosporidium parvum o rotavirus.

Según la estrategia de diseño de los oligonucleótidos se puede hablar de:

- "Standard tiling": Se diseñan 4 oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia de referencia excepto en la posición central donde se interrogan las 4 posibilidades: A, C, GyT;un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para el genotipado de HIV-1 (Affymetrix) . La posición central asegura máxima especificidad.

- "Alternative tiling": En este caso son 5 los oligonucleótidos diseñados, de forma que el quinto interroga una posible deleción en la secuencia; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 (Affymetrix) .

- "Block tiling": Se diseñan 4 oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia normal y otros 4 totalmente complementarios a la secuencia mutante; el nucleótido que cambia se coloca en la posición central, pero 2 nucleótidos antes o después se coloca un "missmatch" que puede ser una de las cuatro bases (A, C, T o G) .; un ejemplo ilustrativo de esta estrategia es el DNA-chip para la detección de mutaciones en el citocromo p450 (Affymetrix) . Dentro de esta última estrategia ["block tiling"] Affymetrix usa el "missmatch" para aumentar la especificidad de la hibridación no sólo en una posición sino en las posiciones -4, -1, 0, +1 y +4 para identificar el cambio producido en la posición central ó 0. Esta estrategia se denomina "Alternative block tiling" y un claro ejemplo es el DNA-chip para la detección de 1.500 SNPs (Affymetrix) .

En el caso de estudios de expresión génica, las sondas depositadas en el vidrio se hibridan con los cDNAs sintetizados a partir de los mRNAs extraídos del tejido que se quiere analizar. Estas moléculas de cDNA han sido marcadas con un fluoróforo al sintetizarse; cuanto mayor sea el número de moléculas que se unen a su secuencia complementaria en el DNA-chip, mayor será la cantidad de fluoróforo que se detecta y mide tras excitarlo con un láser. Esta medida es, por tanto, reflejo del número de moléculas de cada mRNA que había en el tejido analizado y, consecuentemente, reflejo del nivel de expresión de cada gen representado en el DNA-chip, lo que se denomina un patrón de expresión de la célula. Estos DNA-chips de expresión contienen también sondas que representan genes de control ("house-keeping genes") , lo que permite normalizar los resultados y comparar múltiples experimentos de forma cuantitativa. Con un DNA-chip, se pueden determinar en un solo experimento los niveles de expresión de cientos o miles de genes de una célula. El cDNA de la muestra problema y de la muestra control se pueden marcar con dos fluoróforos distintos por lo que en el mismo DNA-chip se pueden estudiar las diferencias entre la expresión de los genes en la muestra control y en la muestra problema.

Los DNA-chips para la detección de polimorfismos genéticos, cambios o mutaciones en general, variaciones génicas, en la secuencia de DNA, comprenden unas superficies sólidas, típicamente de cristal, en las que está depositado un elevado número de secuencias génicas complementarias de cada una de las variaciones génicas que se desea estudiar. Una de las estrategias utilizadas para detectar variaciones génicas consiste en la hibridación de las secuencias que reconocen específicamente al alelo normal y al mutado con fragmentos de DNA procedentes de la muestra que se va a analizar, amplificados mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y marcados con una molécula fluorescente. Al iluminar el DNA-chip con el láser se identifican aquellas secuencias que se han unido a la muestra problema y así se discrimina específicamente un paciente normal de un heterocigoto o un homocigoto mutante. Otra estrategia básica de detección de variaciones génicas con DNA-chips de genotipado consiste en llevar a cabo una reacción de amplificación o extensión sobre el propio DNA-chip.

Dentro de la estrategia de hibridación se puede hacer una subclasificación en función del método de análisis de la información para el genotipado:

- Aumento de la señal de hibridación: Esta estrategia compara la señal de hibridación de las sondas complementarias a los alelos normales y a los alelos mutantes. En general, las muestras mutadas deben presentar una mayor señal de hibridación en las sondas complementarias a los alelos mutantes que en el caso de los individuos normales.

- Pérdida de la señal de hibridación: Los cambios en la secuencia entre una muestra control y una muestra a estudio se pueden identificar por una caída en la señal... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un DNA-chip adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a antígenos eritrocitarios humanos, comprendiendo dicho método:

- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;

- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;

- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;

- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8ó6 réplicas;

- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y

- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles,

comprendiendo dicho DNA-chip un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas útiles para detectar variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes asociadas a antígenos eritrocitarios humanos, en donde, por cada variación génica a detectar, hay 4 sondas, de las cuales 2 sondas detectan una primera variación génica y las otras 2 detectan una segunda variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas, depositadas siguiendo una patrón determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2 áreas que constituyen el DNA-chip pero no agrupadas por variación génica a detectar, y, opcionalmente, unos oligonucleótidos depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y negativos de las reacciones de hibridación, y en donde dichas variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios se seleccionan del grupo formado por el polimorfismo GG87_88insG (Genotipo O4) (BC008) en el exón 2 del gen ABO, el polimorfismo G188A+C189T (Genotipo O1v) (BC012) en el exón 4 del gen ABO, los polimorfismos 261delG (Genotipo O1/O1v) (BC001) , C322T (Genotipo O5) (BC009) en el exón 6 del gen ABO, los polimorfismos C467T (P156L) (Genotipo A2) (BC014) , G542A (Genotipo O8) (BC013) , T646A (Genotipo Ax/O1v) (BC015) , G703A (Genotipo G235S) (B) (BC002) , C796A (Genotipo L266M) (B) (BC003) , G802A (Genotipo O2) (BC004) , G803C (Genotipo G268A) (B, cisAB-1) (BC005) .

79. 804insG (Genotipo O3, Ael) (BC007) , C893T (Genotipo O6) (BC010) , C927A (Genotipo O7) (BC011) , 10591061delC (D FS354+21aa) (Genotipo A2) (BC006) en el exón 7 del gen ABO, los polimorfismos C8G (S3C) (Genotipo weak D type 3) (BC040) , G48A (W16X) (Genotipo RHD W16X) (BC046) , C121T (Q41X) (Genotipo RHD Q41X) (BC047) en el exón 1 del gen RHD, los polimorfismos A178C, G203A, T307C (exon scanning) (BC016, BC017, BC018) , T161C (L54P) (Genotipo DMH) (BC033) , G270A (W90X) (Genotipo RHD W90X) (BC047) , T329C (L110P) (Genotipo DVII) (BC028) en el exón 2 del gen RHD, los polimorfismos C340T (Genotipo weak D type 17) (BC043) , C410T (Genotipo DIIIiv) (BC059) , C446A (A149D) (Genotipo weak D type 5) (BC041) , A455C (Genotipo DIIIa, DIIIiv, DIVa) (BC060) , IVS3+1G>A (Genotipo alelo negativo) (BC049) en el exón 3 del gen RHD, los polimorfismos 488del4 (Genotipo alelo negativo) (BC050) , A497C (H166P) (Genotipo DFW) (BC030) , T509C (M170T) (Genotipo DOL) (BC027) , A514T (Genotipo DFRI) (BC065) , T544A, G577A, A594T (Genotipo DVI-I weak D type 4) (exon scanning) , (BC019, BC020, BC021) en el exón 4 del gen RHD, polimorfismos G635T (G212V) (Genotipo RHD G212V) (BC051) , T667G (Genotipo DIIIa, weak D type 4, Dva, DAR, DOL, DCS) (BC061) , G676C (Genotipo DCS, G686A (Genotipo DHR) (BC031) , G697C (E233Q) , (Genotipo G712A (M238V) (DVI I, weak D type 4, DV, DCS) (BC022, BC023) , A712G (genotipo alelo negativo) (BC023) en el exón 5 del gen RHD, polimorfismos T807G (Genotipo pseudogene) (BC044) , T809G (Genotipo weak D type 1) (BC038) , G845A (G282D) (Genotipo weak D type 15, DIM) (BC037) , C848T (T283I) (Genotipo DHMI) (BC029) , G854A (C285Y) (Genotipo DIM) (BC032) , G885T (M295I) (Genotipo alelo negativo M295I) (BC053) , 906insGGCT (Genotipo alelo negativo) (BC054) , G916A, A932G (consenso exon scanningconsenso exon scanning exon scanning) (BC062, BC063) , IVS6+1del4 (Genotipo alelo negativo) (BC055) en el exón 6 del gen RHD, polimorfismos G941T (G314V) (Genotipo alelo negativo) (BC056) , C990G (Y330X) (Genotipo alelo negativo) (BC057) , G1016A (G339E) (Genotipo weak D type 7) (BC042) , T1025C (I342T) (exon scanning) (BC024) , G1048C (Genotipo DIVa, DIVb) (BC094) , G1057A (G353R) (Genotipo DNU) (BC034) , C1061A (A354N) (Genotipo DII) (BC036) , G1063A (G355S) (Genotipo DNB) (BC026) , T1073C (Genotipo DWI) (BC035) en el exón 7 del gen RHD, polimorfismo IV8+1G>A (Genotipo alelo negativo) (BC058) en el exón 8 del gen RHD, G1154C (G385A) (Genotipo weak D type 2) (BC039) , A1193T (Genotipo DIVb) (BC064) , G1227A (K409K) (Genotipo K409K) (BC045) polimorfismos en el exón 9 del gen RHD, los polimorfismos G106A (A36T) (Genotipo Cx) (BC068) , A122G (Q41R) (Genotipo Cw) (BC067) en el exón 1 del gen RHCE, el polimorfismo T307C (S103P) (Genotipo Rhc) (BC066) en el exón 2 del gen RHCE, el polimorfismo C410T (A137V) (BC059) en el exón 3 del gen RHCE, los polimorfismos C676G (P226A) (Genotipo Ee) (BC025, BC069) , C733G (L245V) (Genotipo VS) (BC070) en el exón 5 del gen RHCE, el polimorfismo G1006T (G336C) (Genotipo VS-/VS+) (BC071) en el exón 7 del gen RHCE, los polimorfismos A697T (Genotipo Kk) (BC073) , C698T (T193M) (Genotipo Kk) (BC072) en el exón 6 del gen KELL, los polimorfismos T961C (R281W) (Genotipo KpaKpb) (BC074) , G962A (R281Q) (Genotipo KpbKpc) (BC075) en el exón 8 del gen KELL, el polimorfismo G1208A (S363N) (Genotipo Kmod-1) (BC077) en el exón 10 del gen KELL, el polimorfismo C1910T (L597P) (Genotipo JsaJsb) (BC076) en el exón 17 del gen KELL, el polimorfismo I5AG>AA (Genotipo JknulI) (BC079) en el exón 6 del gen SLC14A1 (grupo sanguíneo KIDD) , los polimorfismos G838A (D280N) (Genotipo JkaJkb) (BC078) , T871C (S291P) (Genotipo JknulI) (BC080) en el exón 9 del gen SLC14A1 (grupo sanguíneo KIDD) , los polimorfismos T-33C (Genotipo FyGA-TA) (BC082) , G125A (D42G) (Genotipo FyaFyb) (BC081) , C265T (R89C) (Genotipo Fyx) (BC083) en el gen DARC (grupo sanguíneo DUFFY) , los polimorfismos C59T, G71A, T72G (S20L, G42E, G42E) (Genotipo MN) (BC084, BC085) en el exón 2 del gen GYPA, el polimorfismo T143C (M48T) (Genotipo Ss) (BC086) en el exón 4 del gen GYPB, los polimorfismos C790A (Genotipo GpMUR MilII) (BC089) , C850G (Genotipo GpMUR MilII) (BC090) en el exón 3 del gen GYPE, los polimorfismos C230T (Genotipo U) (BC087) , I5+5GT (Genotipo U) (BC088) en el exón 5 del gen GYPB, el polimorfismo T2561C (P854L) (Genotipo DiaDib) (BC091) en el exón 19 del gen SLC4A1 (grupo sanguíneo DIEGO) , el polimorfismo A793G (Genotipo DoaDob) (BC092) en el exón 2 del gen DOMBROCK, el polimorfismo C134T (A45V) (Genotipo CoaCob) (BC093) en el exón 1 del gen COLTON y combinaciones de los mismos.

2. DNA-chip según la reivindicación 1, en el que cada una de dichas 4 sondas para la detección de cada variación génica presentan la base a interrogar en la posición central y tiene una longitud comprendida entre 19 y 27 nucleótidos.

3. Uso de un DNA-chip según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el genotipado simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples variaciones génicas humanas asociadas con antígenos eritrocitarios humanos.

4. Un kit adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a antígenos eritrocitarios humanos que comprende:

- un DNA-chip según las reivindicaciones1ó2;

- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en un método que comprende:

a) extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;

b) amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;

c) someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;

d) poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8ó6 réplicas;

e) introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y f) genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8ó6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles; y, opcionalmente,

- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método.

5. Uso de un kit según la reivindicación 4 para la identificación in vitro de grupos sanguíneos humanos, o el genotipado in vitro de grupos sanguíneos humanos.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS Nº solicitud: 200901845 ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 11.09.2009

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA Fecha de prioridad: 51 Int. Cl. : C12Q 1/68 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas X HASHMI G. et al. "A flexible array format for large-scale, rapid blood group DNA typing". Transfusion. May. 2005. Vol. 45, Nº . 5, pagina.

68. 688. ISSN 0041-1132 (print) . 1-5 Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº : Fecha de realización del informe 31.08.2010 Examinador J. Manso Tomico Página 1/4

Nº de solicitud: 200901845

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TÉCNICA

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación) C12Q Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, EMBASE, BIOSIS, MEDLINE, NPL.XPESP

Informe sobre el Estado de la Técnica (hoja adicional) Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200901845

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 31.08.2010

Declaración Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones 1-5 Reivindicaciones _____________________________________ SÍ NO Actividad inventiva Reivindicaciones _____________________________________ SÍ (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones 1-5 NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como ha sido publicada.

Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 200901845

1. Documentos considerados.

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento Número Publicación o Identificación Fecha Publicación D01 Hashmi G. et al. "A flexible array format for large-scale, rapid blood group DNA typing". Transfusion. May. 2005. Vol. 45, Nº . 5, pagina.

68. 688. ISSN 0041-1132 (print) May- 2005

2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración La presente solicitud divulga un chip de DNA para la puesta en práctica de un método in vitro para el genotipado simultaneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a antígenos eritrocitarios humanos.

La reivindicación 1 y 2 caracterizan el método por comprender las siguientes etapas: extracción del acido nucleído, amplificación de regiones de dicho acido que contienen la variaciones génicas a identificar, fragmentación de dichos productos de amplificación, hibridación de los productos de fragmentación con 4 sondas, por variación, apropiadas fijadas en un soporte, escaneado y cuantificación de la hibridación producida. Las variaciones génicas se seleccionan entre distintos antígenos eritrocitarios. Las sondas presentan la base a interrogar en la posición central y tienen una longitud comprendida entre 19 y 27 nucleótidos. La reivindicación 3 reivindica el uso del chip de DNA. La reivindicación 4 y 5 se refieren a un kit para la puesta en práctica del método desarrollado por el chip.

D01, como documento más cercano del estado de la técnica, divulga el uso de un microarray para el tipaje de los grupos sanguíneos como alternativa a los métodos tradicionales basados en la hemoaglutinación. Ese microarray permite la identificación de distintos SNPs (tabla 1) escogidos entre aquellos alelos que representan una variedad de genes que codifican antígenos eritrocitarios clínicamente relevantes. Para llevar a cabo dicho método se procedió a la extracción del DNA genómico, amplificación de aquellos regiones conteniendo los SNPs a analizar (tabla 2) , hibridación con sondas especialmente diseñadas al efecto y detección espectroscópica de las zonas de hibridación.

Las reivindicaciones objeto de la solicitud no aparecen divulgadas en el estado de la técnica tal y como aparecen en la presente solicitud, por lo que cumplirían con el requisito de novedad. Sin embargo, el DNA chip reivindicado no parece ser más que una mera alternativa al microarray divulgado en el estado de la técnica anterior, ya que la diferencia entre ambos, a saber las disposición de las sondas por cada variante génica a detectar y los polimorfismos seleccionados, no parece ser la responsable de efecto técnico alguno sorprendente, por lo que no cumpliría con el requisito de actividad inventiva.

Informe sobre el Estado de la Técnica (Opinión escrita) Página 4/4


 

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