GENES DE CONTROL PARA LA NORMALIZACIÓN DE DATOS DE ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.

Conjunto de genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente,

en el que el conjunto de genes de control comprende las siguientes secuencias de ARN: SEQ ID 87, SEQ ID 89, SEQ ID 90, SEQ ID 91, SEQ ID 93, SEQ ID 95 y SEQ ID 96

Genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica.

La presente invención se refiere a genes de control, especialmente a un conjunto de genes de control según la reivindicación 1 para la normalización de datos de análisis de la expresión génica, a cebadores de PCR derivados de los genes de control, especialmente al conjunto de cebadores de PCR según la reivindicación 2, a sondas derivadas de genes de control, especialmente al conjunto de sondas según la reivindicación 3, así como a un procedimiento para la normalización de análisis de la expresión génica según la reivindicación 4.

Al igual que antes existe la necesidad de identificar genes, especialmente de células sanguíneas, que en su expresión sólo muestren una mínima variación bajo distintas condiciones. Estos llamados "genes de mantenimiento" ("Housekeeper") se usan como referencias, controles internos y valores de referencia en la cuantificación de la expresión génica y de ARN y ARNm con procedimientos como transferencia Northern, ensayo de protección de ribonucleasas, electroforesis capilar, micromatrices y PCR cuantitativa en tiempo real, así como mediante otros procedimientos para la medición directa de la transcripción y la medición después de la amplificación previa.

A continuación se resumen los términos genes de mantenimiento y genes de control de la expresión por el término genes de control. Esta simplificación se realiza por razones de legibilidad y no representa ninguna limitación de la invención.

Una normalización de datos cuantitativos mediante genes de control tiene numerosas posibilidades de aplicación. Los genes de control hacen posible una identificación de genes cuya actividad se regula de forma diferente en distintos estados de enfermedad, así como el desarrollo de diagnósticos basados en ellos.

Un gen de control es un gen que muestra un cambio mínimo de la expresión y la transcripción a través de distintas muestras de ARN y por tanto sirve de control para la medición de actividades génicas variables a través de distintas muestras. Ningún gen muestra actividad inalterada a través de todos los tejidos. Por tanto, existe una gran necesidad de nuevos genes de control, especialmente para la sangre, ya que diagnósticamente se aplican valores de expresión de la sangre.

Aunque en la bibliografía se conocen distintos genes de control [1], no se conoce ningún gen de control ni sus transcritos, así como su uso combinado, para la normalización de la expresión génica y la transcripción de muestras de sangre completa y células sanguíneas. Los transcritos (también ARNm y microARN, así como otros ARN) con concentración constante en células sanguíneas y en células de órganos y tejido periférico que están localizados en sangre completa constituyen una condición previa para la normalización de las actividades génicas y para la determinación de cambios de otras actividades génicas y, por tanto, una condición previa para el diagnóstico basado en sangre. Igualmente ya se han publicado distintos estudios para la medición de la actividad génica para el diagnóstico/pronóstico de SIRS y sepsis, por ejemplo [2, 3]; sin embargo, todavía no se ha descrito un uso y cuantificación de estas señales de actividad génica mediante genes de control de la sangre.

Por tanto, existe la necesidad de genes de control de la sangre y de células sanguíneas robustos y que dispongan de una estabilidad que haga posible una normalización y cuantificación de la expresión génica de genes específicos para enfermedad o conjuntos de genes.

El punto de partida para la invención dada a conocer en la presente solicitud de patente es el conocimiento de que actividades génicas de distintos genes que están presentes en células sanguíneas en muestras de un individuo al que se le diagnosticaron fenómenos patológicos típicos de sepsis (correspondientemente a la definición en [4]) no se diferencian de las actividades génicas de los mismos genes en individuos en los que no se diagnosticó sepsis y pueden usarse conjuntamente o individualmente como genes de control para la normalización de actividades génicas de células sanguíneas y para la determinación de la concentración de transcritos de sangre. Esto permite la normalización y la cuantificación relativa de actividades de otros genes, lo que puede usarse para el diagnóstico, el pronóstico, la terapia y el control de seguimiento.

Por tanto, el objetivo de la presente invención se basa en poner a disposición agentes y procedimientos que hagan posible un punto de referencia para la diferenciación de cambios en la expresión génica debidos a enfermedad y, por tanto, un diagnóstico o control de seguimiento de la terapia.

Este objetivo se alcanza mediante genes de control y especialmente un conjunto de genes de control con las características caracterizadoras de la reivindicación 1.

El objetivo se alcanza además mediante un cebador derivado del conjunto de genes de control según la reivindicación 1, especialmente el conjunto de cebadores según la reivindicación 2, así como por sondas, especialmente el conjunto de sondas según la reivindicación 3.

Desde el punto de vista de la ingeniería de procesos, el objetivo se alcanza mediante las características caracterizadoras de la reivindicación 4.

La invención describe la identificación de nuevos genes de control de sangre, sondas de micromatrices adecuadas y cebadores de PCR y su uso, también en combinación, para la normalización de datos de expresión cuantitativa de sangre y células sanguíneas en micromatrices, ensayos de PCR en tiempo real y otros sistemas con o sin amplificación y con distintas posibilidades de visualización para la determinación, así como su aplicación al diagnóstico de cambios debidos a enfermedad en inflamaciones locales de diferente localización y en la reacción sistémica a los mismos como SIRS, sepsis, sepsis grave con insuficiencia orgánica.

En estas investigaciones es de importancia decisiva la normalización del análisis de expresión génica. Para los fines de la presente invención por normalización se entenderá lo siguiente:

"Por una normalización se entiende hacer comparables mediciones de distintas matrices o PCR o especialmente experimentos de RT-PCR reduciéndose o eliminándose la variabilidad técnica. Dentro de estos experimentos hay una pluralidad de fuentes que pueden falsear las mediciones. Las posibles fuentes de perturbación técnica son una eficiencia diferente en la transcripción inversa, el marcado o las reacciones de hibridación, así como problemas con las matrices, efectos de carga en los reactivos o condiciones específicas del laboratorio".

El procedimiento según la invención se caracteriza porque en una muestra de sangre de un individuo puede diferenciarse la actividad de uno o varios genes que van a investigarse mediante la comprobación de la presencia y la cantidad del producto génico con respecto a las cantidades de los productos génicos de los genes de control entre SIRS y sepsis.

Para esto se dan a conocer genes de control y secuencias de genes de sangre y células sanguíneas, así como cebadores y sondas derivados de los mismos, que pueden usarse para determinar, visualizar y normalizar y cuantificar actividades génicas y transcritos. Las secuencias de las sondas de oligonucleótidos en la realización preferida se exponen en la Tabla 1 y se corresponden en la lista de secuencias adjunta con SEQ ID 1 a SEQ ID 7, las secuencias de cebadores usadas en la Tabla 2 se corresponden en la lista de secuencias adjunta con SEQ ID 8 a SEQ ID 21. A este respecto, las secuencias de las sondas de oligonucleótidos también pueden asumir otras secuencias, en la realización preferida de una longitud de 50-100 nucleótidos, que unen específicamente transcritos de los genes representados en la Tabla 3 con las secuencias SEQ ID 22 a SEQ ID 97. La longitud de las secuencias usadas en los procedimientos de amplificación como PCR puede ser discrecional en tanto que apoyen la manipulación enzimática deseada y la amplificación.

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1. Conjunto de genes de control para la normalización de datos de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes de control comprende las siguientes secuencias de ARN: SEQ ID 87, SEQ ID 89, SEQ ID 90, SEQ ID 91, SEQ ID 93, SEQ ID 95 y SEQ ID 96.

2. Conjunto de cebadores derivado del conjunto de genes de control según la reivindicación 1 para la normalización de datos de análisis de la expresión génica basados en la amplificación de ácidos nucleicos de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de cebadores comprende las siguientes secuencias de ADN: SEQ ID 8 a SEQ ID 21.

3. Conjunto de sondas derivado del conjunto de genes de control según la reivindicación 1 para la normalización de datos de análisis de la expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de sondas comprende las siguientes secuencias de ADN: SEQ ID 1 a SEQ ID 7, así como sus secuencias de ácidos nucleicos complementarios.

4. Procedimiento para la normalización de datos de análisis de la expresión génica con un conjunto de ácidos nucleicos de control seleccionado de un conjunto de genes de control según la reivindicación 1 o de un conjunto de cebadores según la reivindicación 2 o de un conjunto de sondas según la reivindicación 3, en el que

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la transformación matemática de los datos de señales se realiza mediante el arsenh o mediante un enfoque logarítmico.

6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque el ensayo de expresión génica comprende las siguientes etapas:

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los ácidos nucleicos comprenden ARNm o microARN.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-7, en el que los ácidos nucleicos se amplifican mediante PCR, PCR en tiempo real, NASBA, TMA o SDA.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6-8, en el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control y de prueba se determinan mediante procedimientos de hibridación.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-9, en el que la medición de los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control y/o de prueba se realiza en disolución o en ácidos nucleicos que están inmovilizados en un soporte.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el soporte es una micromatriz, partícula, perla, vidrio, metal o membrana.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4-11, en el que los ácidos nucleicos de control y/o de prueba están acoplados indirectamente al soporte mediante otros componentes de unión como anticuerpos, antígenos, oligonucleótidos, balizas moleculares o enzimas; y/o en el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos de control y de prueba determinados in vitro a partir de una muestra de paciente se utilizan como parámetros de entrada para la preparación de software para la descripción del pronóstico individual de un paciente, para fines de diagnóstico, para las decisiones de terapia y/o sistemas de gestión de datos de pacientes.

13. Uso de un conjunto de ácidos nucleicos de control seleccionado de un conjunto de genes de control según la reivindicación 1 o de un conjunto de cebadores según la reivindicación 2 o de un conjunto de sondas según la reivindicación 3 para la normalización de un procedimiento de análisis de la expresión génica para el diagnóstico de enfermedades con reacción inmunitaria sistémica.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que las enfermedades se seleccionan de: sepsis, sepsis grave, choque séptico o insuficiencia multiorgánica.

15. Uso según la reivindicación 13 ó 14 en un procedimiento para el diagnóstico in vitro de SIRS, sepsis, sepsis grave, choque séptico o insuficiencia multiorgánica en un individuo usando conjuntos de ácidos nucleicos de control y ácidos nucleicos de prueba cuya expresión es específica para SIRS o sepsis que comprende las siguientes etapas: