Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W).

Un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D o de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D,

que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de gruposanguíneo de un sujeto, comprendiendo el método:

determinar al menos 4 marcadores en una muestra que se ha obtenido del sujeto,

en donde los marcadores comprenden:

(i) la presencia o ausencia de un alelo de RHCE*C;

(ii) la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03);

(iii) la ausencia de, o una variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) dentro de, uno cualquiera delexón 4 de RHD, el exón de RHD o el exón 6 de RHD; y

(iv) la ausencia de, o variante de SNP dentro del, exón 7 de RHD,

en el que:

la ausencia de dicho alelo de RHCE*C; la presencia de dicho alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE; laausencia del exón 4 de RHD, exón 5 de RHD o exón 6 de RHD; y la ausencia del exón 7 de RHD encombinación indican que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D odicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE(4-7)-D.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10197481.

Solicitante: PROGENIKA BIOPHARMA, S.A..

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: MARTINEZ, ANTONIO, OCHOA,JORGE, LOPEZ,MONICA, TEJEDOR,DIEGO, SIMON,LAUREANO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

PDF original: ES-2445709_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican antígeno C alterado (C+W) 5

Campo de la invención La invención se refiere a métodos para genotipación y determinación de antígenos de células sanguíneas, que en particular pueden diferenciar las variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o RHD*DIIIa-CE (4-7) -D) , que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo. La invención también se refiere a productos, en particular sondas, cebadores y kits para su uso en dichos métodos.

Antecedentes de la invención El éxito de la transfusión sanguínea depende con frecuencia del grado de compatibilidad entre el donante y el receptor. El grado de compatibilidad, a su vez, está en función de la similitud en contenido de antígeno de glóbulos rojos (RBC) entre el donante y el receptor. La mayoría de los antígenos de RBC en un individuo pueden predecirse de una manera sencilla a partir del análisis de su ADN genómico. Por lo tanto, puede usarse análisis del ADN del donante y/o receptor para predecir el grado de compatibilidad y de este modo permitir la práctica de transfusión sanguínea apropiada.

Las reacciones hemolíticas son más habituales en individuos con múltiples transfusiones que con transfusiones individuales, no solamente por la mayor probabilidad de dicho acontecimiento a medida que aumenta el número de unidades transfundidas, sino también debido a la naturaleza dirigida por memoria inmunológica acumulativa de la respuesta inmunitaria en el receptor. Un ejemplo de una afección cuyo tratamiento incluye transfusiones sanguíneas repetidas es la Anemia Falciforme (SCD) . Se deduce por lo tanto que un alto grado de compatibilidad con la sangre del donante es con frecuencia crítico para el éxito de la transfusión en pacientes con SCD.

Aunque la SCD es más prevalente entre individuos de orígenes africanos, la población donante de sangre en los Estados Unidos y otros países occidentales es en su mayoría caucásica. Como consecuencia de esta disparidad, las diferencias de antígenos de RBC entre ambos grupos raciales con frecuencia son responsables de fracasos en transfusiones de sangre en pacientes con SCD.

La variante genética RHD*DIIIa-CE (4-7) -D (también conocida como RHD-CE-DS, RHD-CE (4-7) -D, (C) ceS, o r’S) puede encontrarse en aproximadamente el 5 % de la población afroamericana, pero no se ha indicado en caucásicos. Esta variante presenta un especial reto a la transfusión de sangre debido a que codifica un perfil antigénico bastante complejo, que incluye ausencia de antígeno D, formas alteradas de antígenos C (C+W) y e, expresión de antígeno VS de baja frecuencia, no expresión de antígeno V, y ausencia del antígeno hrB de alta frecuencia. Los perfiles antigénicos de D y C son los clínicamente más relevantes para determinar la compatibilidad entre donantes de sangre y pacientes de transfusión.

La complejidad antigénica de RHD*DIIIa-CE (4-7) -D se correlaciona con su complejidad genética, que incluye cambios en el gen RHD, con una sustitución de parte del exón 3 de RHD, exones 4-7 de RHD, y los intrones 45 intermedios por sus homólogos de RHCE, una sustitución G>T en la posición 186 (exón 2) , una sustitución C>T en la posición 410 (exón 3 híbrido) , una sustitución C>G en la posición 733 (exón 5) , y una sustitución G>T en la posición 1006 (exón 7) . Además de los cambios en el gen RHD, RHD*DIIIa-CE (4-7) -D aparece en cis con un gen RHCE que codifica sustituciones C>G en la posición 733 (exón 5) y G>T en la posición 1006 (exón 7) . El fenotipo C+W se caracteriza por expresión débil del antígeno Rh C.

Para añadir a la complejidad antigénica y genética, el conocimiento de los inventores acerca de la base molecular de RHD*DIIIa-CE (4-7) -D está incompleto. Por ejemplo, los puntos precisos de recombinación RHCE/RHD en el intrón 3

o intrón 7 no se han presentado hasta la fecha. Además, se han descrito dos tipos de variantes RHD*DIIIa-CE (4-7) -D (Tipo 1 y Tipo 2) , que difieren tanto en su composición genética como en sus perfiles antigénicos, aunque los 55 perfiles antigénicos de D y C clínicamente relevantes son iguales. Puede haber otros fenotipos de tipo RHD*DIIIaCE (4-7) -D, que también tienen un perfil antigénico D- y C+W. Clínicamente, es por lo tanto muy importante distinguir RHD*DIIIa-CE (4-7) -D y otros fenotipos de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D de fenotipos con diferentes perfiles antigénicos de C y D.

Varias publicaciones (Referencias 1-3) han examinado la similitud genética entre RHD*DIIIa-CE (4-7) -D y otras variantes de RHD, en particular RHD*DIIIa y RHD*DIVa-1/RHD*DIVa-2 (en lo sucesivo RHD*DIVa-2) . Varios métodos moleculares para la detección específica de RHD*DIIIa-CE (4-7) -D se han basado en la detección de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) localizados en el exón 3 híbrido. Se sabe ahora que estos SNP están compartidos con las variantes RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2. En consecuencia, la identificación de RHD*DIIIa-CE (4-7) -D 65 en una muestra por análisis de ADN requiere detección de los SNP del exón 3 híbrido y diferenciación de RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2, que es difícil con los métodos actuales de genotipación. Esta diferenciación es clínicamente relevante puesto que RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2 codifican un perfil antigénico diferente, que incluye expresión de D parcial y ausencia de C+W (es decir D parcial, C-) . También es importante distinguir entre otras variantes genéticas que también pueden compartir estos SNP de exón 3 híbrido pero codifican diferentes combinaciones de antígenos D y C, que también pueden ser clínicamente relevantes.

El documento WO 2006/075254 describe métodos y productos para genotipación in vitro.

Advent et al., 2009, Transfusion Medicine and Hemotherapy, Vol. 36, Nº 3, pp. 162-167, describe el proyecto bloodgen de la Unión Europea.

Westhoff et al., 2010, Transfusion, Vol. 50, Nº 6, pp. 1303-1311, presenta que DIIIa y DIII Tipo 5 están codificados por el mismo alelo y se asocian con alelos RHCE*ce alterados.

Pham et al., 2009, Transfusion, Vol. 49, Nº 3, pp. 495-504, describe el fondo molecular heterogéneo del fenotipo C 15 débil, VS+, hr (B) -, Hr (B) - en personas negras.

El documento WO 2006/032897 describe análisis génicos, particularmente de los genes ABO y RHD.

El documento DE 10049363 describe un kit de diagnóstico, una micromatriz y su uso para la determinación del factor Rh en un ser humano, por ejemplo en diagnóstico prenatal.

Faas et al., 1995, BLOOD, Vol. 85, Nº 3, pp. 829-832, describe genotipación de Rh E/e por amplificación de cebadores específicos de alelo.

Maaskant-van Wijk et al., 1998, Transfusion, Vol. 11, Nº 38, pp. 1015-1021, describe genotipación de RHD por análisis de reacción en cadena de la polimerasa múltiple de seis exones específicos de RHD.

El documento WO 2011/003921 describe métodos y productos para genotipación in vitro.

Algunas de estas otras variantes de RHD han identificado, por ejemplo RHD*DIVb-4, RHD*tipoDdébil4.0, RHD*tipoDdébil4.1, RHD*tipoDdébil14, RHD*tipoDdébil51, RHD*DAR, RHD*DAR-E, RHD*ex04-ex07del, RHD*ex03del y RHD*ex03-ex04del, que tienen expresión variada del antígeno D.

Los reactivos de anticuerpo habitualmente usados para detectar antígeno C no diferencian entre C+W y C+. Por lo tanto, el fenotipo con frecuencia se indica como C+. En casos en los que el reactivo de anticuerpo no diferencia entre C+W y C+ pero la muestra contiene un alelo RHCE*C normal en trans para un alelo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D, C+W está ocultado por C+, dando como resultado un fenotipo C+ para la muestra.

Esto hace difícil determinar el fenotipo correcto para perfiles antigénicos C+W/C-, C+W/C+W, C+W/C+ y C+/C+ usando análisis de serología solamente. Por lo tanto, es necesario ensayar con respecto a RHCE*C y mostrar que está ausente antes de la asignación de un fenotipo C+W a una muestra, y por lo tanto los métodos actuales de diagnóstico de un perfil antigénico RHD*DIIIa-CE (4-7) -D son difíciles incluso cuando se realiza tanto análisis de serología como análisis genético.

Sumario de la invención Los inventores han descubierto un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D) , que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa2 y otras variantes de grupo sanguíneo, determinando al menos cuatro marcadores genéticos. El método no requiere el uso de anticuerpos, y permite la predicción de los fenotipos de antígeno... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupo sanguíneo de un sujeto, comprendiendo el método:

determinar al menos 4 marcadores en una muestra que se ha obtenido del sujeto, en donde los marcadores comprenden:

(i) la presencia o ausencia de un alelo de RHCE*C;

(ii) la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE (RHD/CE Hex03) ;

(iii) la ausencia de, o una variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) dentro de, uno cualquiera del exón 4 de RHD, el exón 5 de RHD o el exón 6 de RHD; y

(iv) la ausencia de, o variante de SNP dentro del, exón 7 de RHD,

en el que:

la ausencia de dicho alelo de RHCE*C; la presencia de dicho alelo del exón 3 híbrido de RHD/RHCE; la ausencia del exón 4 de RHD, exón 5 de RHD o exón 6 de RHD; y la ausencia del exón 7 de RHD en combinación indican que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o dicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

a) la variante de SNP dentro del exón 4 de RHD está en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355) , b) la variante de SNP dentro del exón 5 de RHD está en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD (rs1053356) , c) la variante de SNP dentro del exón 6 de RHD está en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD; y/o d) la variante de SNP dentro del exón 7 de RHD está en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD (rs41307826) ,

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los marcadores comprenden además:

(v) la presencia o ausencia de un alelo del exón 3 de RHD,

en el que la ausencia de dicho exón 3 de RHD indica además que la muestra contiene dicha variante de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o dicha variante de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:

a) el método comprende además determinar los fenotipos de antígenos RHD y RHC del sujeto de acuerdo con la Tabla 1; y/o b) el método comprende detectar la presencia o la ausencia de una variante de grupo sanguíneo seleccionada de: RHD*DIIIa; RHD*DIVa-2; o variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D, por ejemplo en el que el método comprende detectar la presencia o la ausencia de variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D o variantes de grupo sanguíneo de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D; y/o c) el marcador (iii) es el SNP dentro del exón 4 de RHD en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355) ; y/o d) el alelo de RHCE*C se determina determinando la presencia o la ausencia del intrón 2 de RHCE*C, o una cualquiera de las siguientes posiciones en la secuencia codificante de RHCE: posición 307 (exón 2) , posición 48 (exón 1) , posición 150 (exón 2) , posición 178 (exón 2) , posición 201 (exón 2) y/o posición 203 (exón 2) ,

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1 y en el que la secuencia codificante de RCHE es como se expone en SEC ID Nº: 2.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra comprende ácido nucleico y el método comprende amplificar el ácido nucleico o una parte del mismo por PCR usando cebadores, por ejemplo en el que:

a) los cebadores de PCR para determinar el alelo de RHCE*C son un cebador de PCR directo específico para RHCE*C y un cebador de PCR inverso no específico, por ejemplo en donde

(i) el cebador inverso no específico está compartido con RHD, RHC*C y/o RHC*c; y/o

(ii) los cebadores de PCR comprenden:

Directo: 5’-GGCCACCACCATTTGAA-3’ (SEC ID Nº: 3) Inverso: 5’-CCATGAACATGCCACTTCAC-3’, (SEC ID Nº: 4) ; y/o

b) los cebadores de PCR para determinar el alelo de RHD/CE Hex03 son cebadores de PCR directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 2 y 3, o intrones 3 y 2, respectivamente, por ejemplo en donde (i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 9) Cebador inverso: 5’-TTTTCAAAACCCCGGAAG-3 (SEC ID Nº: 10) ;

y/o c) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 4 de RHD en la posición 602 de la secuencia codificante de RHD (rs1053355) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 3 y 4, o intrones 4 y 3, respectivamente, por ejemplo en donde (i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-GCTCTGAACTTTCTCCAAGGACT-3’ (SEC ID Nº: 17) Cebador inverso: 5’-ATTCTGCTCAGCCCAAGTAG-3’ (SEC ID Nº: 18) ; y/o

d) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 5 de RHD en la posición 667 de la secuencia codificante de RHD (rs1053356) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 4 y 5, o intrones 5 y 4, respectivamente, por ejemplo en donde (i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-TTGAATTAAGCACTTCACAGAGCA-3’ (SEC ID Nº: 19) Cebador inverso: 5’-CACCTTGCTGATCTTCCC-3’ (SEC ID Nº: 20) ; y/o

e) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 6 de RHD en la posición 819 de la secuencia codificante de RHD son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 5 y 6, o intrones 6 y 5, respectivamente, por ejemplo en donde (i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-AGTAGTGAGCTGGCCCATCA-3’ (SEC ID Nº: 21) Cebador inverso: 5’-CTTCAGCCAAAGCAGAGGAG-3’ (SEC ID Nº: 22) ; y/o

f) los cebadores de PCR para determinar el SNP dentro del exón 7 de RHD en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD (rs41307826) son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 6 y 7, o intrones 7 y 6, respectivamente, por ejemplo en los que (i) los cebadores de PCR comprenden:

Cebador directo: 5’-ACAAACTCCCCGATGATGTGAGTG-3’ (SEC ID Nº: 35) Cebador inverso: 5’-GAGGCTGAGAAAGGTTAAGCCA-3’ (SEC ID Nº: 36) ; y/o

g) dependiendo de la reivindicación 3, los cebadores de PCR para determinar el alelo del exón 3 de RHD son cebadores directo e inverso que se dirigen a secuencias localizadas en los intrones 2 y 3, o intrones 3 y 2, respectivamente, por ejemplo en donde (i) los cebadores de PCR comprenden: Cebador directo: 5’-TCCTGGCTCTCCCTCTCT-3’ (SEC ID Nº: 15)

Cebador inverso: 5’-GTTGTCTTTATTTTTCAAAACCCT-3’ (SEC ID Nº: 16) ; en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el ácido nucleico amplificado comprende un marcador, por ejemplo en el que a) el marcador comprende un nucleótido biotinilado; y/o b) el marcador comprende un resto fluorescente.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra comprende ácido nucleico, y el método comprende amplificar el ácido nucleico o una parte del mismo por PCR usando cebadores, fragmentar el ácido nucleico amplificado y marcar el ácido nucleico fragmentado con ddNTP biotinilados usando una enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) .

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que determinar la presencia, la ausencia o la variante de SNP de un marcador comprende poner en contacto ácido nucleico que contenga cada marcador con una o más sondas, por ejemplo, en el que:

a) dependiendo de la reivindicación 3, las sondas para determinar la presencia o la ausencia de RHD/CE Hex03

o el exón 3 de RHD entran en contacto con un SNP localizado tanto en RHD/CE Hex03 como en el exón 3 de RHD, en el que una variante de SNP es específica para RHD/CE Hex03 y otra variante de SNP es específica para el exón 3 de RHD, por ejemplo en el que

(i) el SNP está en la posición 410 de la secuencia codificante, localizada tanto dentro de RHD/CE Hex03 como del exón 3 de RHD; y/o

(ii) las sondas comprenden:

(1) 5’-TTTTACAGACGCCTGCTACCATG-3’, (SEC ID Nº: 5)

(2) 5’-CATGGTAGCAGGCGTCTGTAAAA-3’, (SEC ID Nº: 6)

(3) 5’-TTTTACAGACGTCTGCTACCATG-3’, (SEC ID Nº: 7) y

(4) 5’-CATGGTAGCAGACGTCTGTAAAA-3’, (SEC ID Nº: 8) ; y/o

b) las sondas para determinar la ausencia o la variante de SNP del SNP en: posición 602 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 4 (rs1053355) , posición 667 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 5 (rs1053356) , o posición 819 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 6 comprenden:

(i) exón 4 de RHD:

(1) 5’-ATAAAGATCAGACAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 23)

(2) 5’-TAAAGATCAGACAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 24)

(3) 5’-ATAAAGATCAGAGAGCAACGATACC-3’ (SEC ID Nº: 25)

(4) 5’-TAAAGATCAGAGAGCAACGATAC-3’ (SEC ID Nº: 26) ;

(ii) exón 5 de RHD:

(1) 5’-CTGGCCAAGTTTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 27)

(2) 5’-TGGCCAAGTTTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 28)

(3) 5’-CTGGCCAAGTGTCAACTCTGC-3’ (SEC ID Nº: 29)

(4) 5’-TGGCCAAGTGTCAACTCTG-3’ (SEC ID Nº: 30) ;

(iii) exón 6 de RHD:

(1) 5’-GTGCACAGTGCGGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 31)

(2) 5’- TGCACAGTGCGGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 32)

(3) 5’- GTGCACAGTGCAGTGTTGGCAGG-3’ (SEC ID Nº: 33)

(4) 5’-TGCACAGTGCAGTGTTGGCAG-3’ (SEC ID Nº: 34) ; y/o

c) las sondas para determinar la variante de SNP del SNP en la posición 1048 de la secuencia codificante de RHD localizada dentro del exón 7 (rs41307826) comprenden:

(1) 5’-TGCTGGTGCTTGATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 37)

(2) 5’-GCTGGTGCTTGATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 38)

(3) 5’-TGCTGGTGCTTCATACCGTCGGA-3’ (SEC ID Nº: 39)

(4) 5’-GCTGGTGCTTCATACCGTCGG-3’ (SEC ID Nº: 40) ;

en el que la secuencia codificante de RHD es como se expone en SEC ID Nº: 1.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que a) una o más de las sondas comprenden un marcador, por ejemplo en el que el marcador es un resto fluorescente; y/o b) una o más de las sondas están unidas con un soporte sólido o conjugadas con una o más partículas.

10. Uso de un conjunto de cebadores en un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIaCE (4-7-D) o de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes del grupo sanguíneo, amplificando ácido nucleico que comprende al menos los cuatro marcadores de la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende al menos tres pares de cebadores seleccionados de los cebadores expuestos en:

(i) reivindicación 5 (a) ,

(ii) reivindicación 5 (b) ,

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 5 (c) , 5 (d) o 5 (e)

(iv) reivindicación 5 (f) , y

(v) reivindicación 5 (g) .

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el conjunto de cebadores comprende al menos tres pares de cebadores seleccionados de los cebadores expuestos en:

(i) reivindicación 5 (a) (ii) ,

(ii) reivindicación 5 (b) (i) ,

(iii) una cualquiera de las reivindicaciones 5 (c) (i) , 5 (d) (i) o 5 (e) (i) ,

(iv) reivindicación 5 (f) (i) , y

(v) reivindicación 5 (g) (i) .

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10 o reivindicación 11, en el que al menos el 50 % de los cebadores en el conjunto son los pares de cebadores definidos en la reivindicación 10 u 11.

13. Uso de un conjunto de sondas en un método para diferenciar las variantes de grupo sanguíneo RHD*DIIIa-CE (4-7-D) o de tipo RHD*DIIIa-CE (4-7) -D, que expresan el antígeno C+W y carecen de un antígeno D, de RHD*DIIIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes del grupo sanguíneo, determinando la presencia, la ausencia o la variante de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) de al menos los cuatro marcadores de la reivindicación 1, en el que el conjunto de cebadores comprende:

(i) las sondas de SEC ID Nº: 5, 6, 7 y 8;

(ii) las sondas de SEC ID Nº: 23, 24, 25 y 26;

(iii) las sondas de SEC ID Nº: 31, 32, 33 y 34

(iv) las sondas de SEC ID Nº: 27, 28, 29 y 30; y

(v) las sondas de SEC ID Nº: 37, 38, 39 y 40.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en el que:

a) las sondas se inmovilizan en un soporte sólido o se conjugan con una o más partículas, por ejemplo en el que el soporte sólido comprende uno o más marcadores unidos, por ejemplo en el que el marcador es un fluorocromo; y/o b) una o más sondas comprenden un marcador, por ejemplo en el que marcador es un resto fluorescente.

15. Uso de un kit para genotipar un sujeto, comprendiendo el kit un conjunto de cebadores de PCR como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, y un conjunto de sondas como se han definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.


 

Patentes similares o relacionadas:

Método para analizar ácido nucleico molde, método para analizar sustancia objetivo, kit de análisis para ácido nucleico molde o sustancia objetivo y analizador para ácido nucleico molde o sustancia objetivo, del 29 de Julio de 2020, de Kabushiki Kaisha DNAFORM: Un método para analizar un ácido nucleico molde, que comprende las etapas de: fraccionar una muestra que comprende un ácido nucleico molde […]

MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMOS ATÓPICOS SENSIBLES A COMPONENTES ALERGÉNICOS DEL POLEN DE OLEA EUROPAEA (OLIVO), del 23 de Julio de 2020, de SERVICIO ANDALUZ DE SALUD: Biomarcadores y método para el diagnostico, estratificación, seguimiento y pronostico de la evolución de la enfermedad alérgica a polen del olivo, kit […]

Detección de interacciones proteína a proteína, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Un método para medir cuantitativamente la fuerza y la afinidad de una interacción entre una primera proteína de membrana o parte de la misma y una […]

Secuenciación dirigida y filtrado de UID, del 15 de Julio de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Un procedimiento para generar una biblioteca de polinucleótidos que comprende: (a) generar una primera secuencia del complemento (CS) de un polinucleótido diana a partir […]

Métodos para la recopilación, estabilización y conservación de muestras, del 8 de Julio de 2020, de Drawbridge Health, Inc: Un método para estabilizar uno o más componentes biológicos de una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo el método obtener un […]

Evento de maíz DP-004114-3 y métodos para la detección del mismo, del 1 de Julio de 2020, de PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.: Un amplicón que consiste en la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 32 o el complemento de longitud completa del mismo.

Aislamiento de ácidos nucleicos, del 24 de Junio de 2020, de REVOLUGEN LIMITED: Un método de aislamiento de ácidos nucleicos que comprenden ADN de material biológico, comprendiendo el método las etapas que consisten en: (i) efectuar un lisado […]

Composiciones para modular la expresión de SOD-1, del 24 de Junio de 2020, de Biogen MA Inc: Un compuesto antisentido según la siguiente fórmula: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .