Un procedimiento que identifica un gen o genes candidatos implicados en la memoria dependiente de la transcripción de aprendizaje asociativo que comprende las etapas de:

(a) entrenar animales no humanos para inducir la formación de memoria dependiente de la transcripción en dichos animales; (b) extraer ARN de tejido cerebral de dichos animales entrenados en la etapa (a); (c) sintetizar sondas de ADN usando el ARN extraído en la etapa (b); (d) hibridar las sondas de ADN sintetizadas en la etapa (c) a secuencias de ADN complementarias sobre procesadores de microdisposiciones que contienen secuencias de ADN a partir de genes del genoma de dichos animales, en el que una señal se produce tras la hibridación de dichas sondas a secuencias de ADN complementarias; (e) detectar la señal producida en la etapa (d); y (f) realizar una comparación estadística entre la señal detectada en la etapa (e) y la señal detectada en un control para cada gen usando un algoritmo de transformación de señal, en el que dicho control se obtiene de acuerdo con un procedimiento que comprende las etapas de: (i) extraer ARN de tejido cerebral de animales control no humanos entrenados para inducir formación de memoria independiente de la transcripción pero no formación de memoria dependiente de la transcripción asociada a dichos animales control; (ii) sintetizar sondas de ADN que usan el ARN extraído en la etapa (f) (i); e (iii) hibridar las sondas de ADN sintetizadas en la etapa (f) (ii) a secuencias de ADN complementarias sobre procesadores de disposiciones que contienen secuencias de ADN de los genes del genoma de los animales control, en el que se produce una señal tras la hibridación de dichas sondas a secuencias de ADN complementarias; y en el que la formación de memoria en el animal de la etapa (a) se induce usando un protocolo de entrenamiento espaciado y la formación de memoria en los animales control se induce usando un protocolo de entrenamiento en masa; y tanto el protocolo de entrenamiento espaciado como el protocolo de entrenamiento en masa usan procedimientos de condicionamiento pavloviano con un estímulo condicionado y un estímulo no condicionado que están temporalmente emparejados; y en el que una diferencia estadísticamente significativa entre la la señal detectada en la etapa (e) y la señal detectada en un control para cada gen indica un gen de memoria candidato implicado en la memoria asociativa dependiente de la transcripción

Antecedentes de la invención

Un atributo que muchos organismos, incluyendo seres humanos, poseen es la memoria de episodios pasados. Este atributo se ha estudiado durante muchas décadas con mucha información ahora disponible que explica muchas de sus ramificaciones. Por ejemplo, se han identificado dos tipos básicos de memoria: memoria independiente de la transcripción, que incluye memoria a corto plazo.

Un aspecto relativamente conocido hasta ahora de memoria es la identidad de genes que contribuye a su manifestación. La identidad de los genes que contribuyen a la formación de memoria está justo ahora comenzando a explorarse. La identificación de genes asociados a la formación de memoria proporcionaría (a) una epidemiología genética de disfunción cognitiva, (b) herramientas de diagnóstico para individuos que llevan formas alélicas diferentes de estos genes (en asociación con diferentes niveles de comportamiento para formas particulares de cognición) y (c) nuevas dianas para descubrimiento de fármacos últimamente para mejorar varias formas de disfunción cognitiva (y particular fármacos se pueden equiparar a formas particulares de disfunción cognitiva mediante ensayos de diagnóstico). De este modo, sería útil tener técnicas disponibles que identificaran los genes que están asociados a la formación de memoria.

Cavallaro S et al., PNAS, 94:9669 - 9673 (1997) divulga el uso de identificación de ARN para identificar los genes relacionados con la memoria. Tully et al., Society for Neuroscience abstracts, vol. 19, no. 1/3:1066 (1993) describe que se inducen memorias independientes en Drosophila después de condicionamiento pavloviano usando protocolos de entrenamiento en masa y espaciado. El documento WO9849342 describe el uso de microdisposiciones para preparar un patrón de transcripción de gen diagnóstico estándar.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de los solicitantes de que los efectos diferenciales sobre la formación de memoria producida por ciertos protocolos experimentales se pueden usar para identificar genes implicados en la formación de memoria dependiente de la transcripción, particularmente la formación de memoria a largo plazo. La diferencia significativa entre cualquiera de los dos protocolos experimentales está en la inducción de memoria dependiente de la transcripción. La diferencia significativa entre cualquiera de los dos protocolos experimentales a compararse es la inducción de la memoria dependiente de la transcripción en el grupo experimental y la ausencia de memoria dependiente de la transcripción en el grupo control.

Memoria independiente de la transcripción incluye diversas "fases de memoria", tal como memoria a corto plazo, memoria a plazo intermedio (o medio) y memoria resistente a anestesia (en moscas). En común con estas formas es que los inhibidores farmacológicos de la transcripción de ARN no alteran estas memorias. Memoria dependiente de la transcripción usualmente se refiere a memoria a largo plazo e inhibidores de la síntesis de ARN bloquean su aparición.

Como resultado, la invención de los solicitantes se refiere a procedimientos de identificación de un gen o genes implicados en la memoria independiente de la transcripción (particularmente memoria a largo plazo) que comprende

(a) entrenamiento de animales no humanos (particularmente mamíferos no humanos, otros vertebrados e invertebrados) como se establece en la reivindicación 1.

Las condiciones experimentales de la etapa (a) y etapa (i) constituyen un par de tratamientos (experimentales). La diferencia significativa entre las condiciones experimentales de la etapa (a) y etapa (i) está en la inducción de memoria dependiente de la transcripción.

Como se usa en el presente documento, un animal de control es un animal que es de la misma especie como, y de otra manera comparable con (por ejemplo, edad, sexo similar), el animal que está entrenado en condiciones suficientes para inducir formación de memoria dependiente de la transcripción en ese animal.

En una realización particular, ARN se extrae de la amígdala de animales entrenados o de control. En otra realización, ARN se extrae del hipocampo de animales entrenados o de control. En todavía otra realización, la señal de sondas hibridadas se amplifica, antes de la detección. En otra realización, se realiza una comparación estadística (realizada, llevada a cabo) entre la señal detectada en la etapa (e) y la señal detectada en un control que se obtiene mediante entrenamiento de animales control en condiciones suficientes para inducir memoria independiente de la transcripción pero no en la memoria dependiente de la transcripción.

La memoria dependiente de la transcripción se puede inducir usando condiciones experimentales específicas. En una realización, memoria dependiente de la transcripción se induce en un animal no humano usando un protocolo de entrenamiento espaciado para la respuesta de evitación potenciada por el miedo. Memoria dependiente de la transcripción se puede inducir en un animal no humano usando un protocolo de evasión de caja de evitación. En otra realización, memoria dependiente de la transcripción se induce en un animal no humano usando un protocolo de condicionamiento de miedo contextual.

La invención también se refiere a un procedimiento de identificación de un gen o genes implicados en la memoria dependiente de la transcripción en Drosophila.

Como se usa en el presente documento, una Drosophila control es una Drosophila que es de la misma especie que, y de otra manera comparable a, la Drosophila que se entrena en condiciones suficientes para inducir la memoria dependiente de la transcripción en esa Drosophila.

En una realización del procedimiento de identificación de un gen o genes implicados en la memoria dependiente de la transcripción en Drosophila, las sondas de ADN se marcan con un marcador fluorescente y se detecta la señal usando un ensayo de fluorescencia. En una realización particular, la señal de las sondas hibridadas se amplifica antes de la detección. En la invención, se realiza una comparación estadística entre la señal detectada en la etapa

(e) y la señal detectada en un control que se obtiene mediante entrenamiento de Drosophila control en condiciones suficientes para inducir memoria independiente de la transcripción pero no memoria dependiente de la transcripción.

Memoria dependiente de la transcripción se puede inducir en Drosophila usando un protocolo de entrenamiento espaciado (por ejemplo, entrenamiento espaciado de condicionamiento Pavloviano olfativo). Memoria independiente de la transcripción se puede inducir en Drosophila usando un protocolo de entrenamiento en masa (entrenamiento en masa de condicionamiento Pavloviano olfativo).

Una diferencia estadísticamente significativa en nivel de transcripción para un gen específico entre animales entrenados en condiciones suficientes para inducir memoria dependiente de la transcripción y animales control entrenados en condiciones apropiados que no son suficientes para inducir memoria dependiente de la transcripción identifica ese gen como un gen de memoria candidato (CMG). Una diferencia estadísticamente significativa en nivel de transcripción entre grupos entrenados espaciados y en masa para un gen específico identifica ese gen como un gen de memoria candidato.

Una diferencia estadísticamente significativa en nivel de transcripción para un gen específico entre animales entrenados en condiciones suficientes para inducir memoria dependiente de la transcripción y animales de control vírgenes (sin entrenar) identifica ese gen como un gen de plasticidad candidato (CPG). En una realización particular, una diferencia estadísticamente significativa en nivel de transcripción entre grupos entrenados espaciados y no entrenados para un gen específico identifica ese gen como un gen de plasticidad candidato.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama específico de un protocolo de entrenamiento descrito en Tully et al., Cell, 79:35 - 47 (1994)), que produce aprendizaje olfativo Pavloviano en moscas.

La Figura 2 es una representación gráfica de resultados que muestra retención de memoria después de entrenamiento espaciado o en masa en moscas normales (tipo salvaje) o entrenamiento espaciado en moscas hsCREB2-r transgénicas después de la expresión inducida del represor CREB (véase Yin et al., Cell, 79:49 - 58... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento que identifica un gen o genes candidatos implicados en la memoria dependiente de la transcripción de aprendizaje asociativo que comprende las etapas de:

(a) entrenar animales no humanos para inducir la formación de memoria dependiente de la transcripción en dichos animales;

(b) extraer ARN de tejido cerebral de dichos animales entrenados en la etapa (a);

(c) sintetizar sondas de ADN usando el ARN extraído en la etapa (b);

(d) hibridar las sondas de ADN sintetizadas en la etapa (c) a secuencias de ADN complementarias sobre procesadores de microdisposiciones que contienen secuencias de ADN a partir de genes del genoma de dichos animales, en el que una señal se produce tras la hibridación de dichas sondas a secuencias de ADN complementarias;

(e) detectar la señal producida en la etapa (d); y

(f) realizar una comparación estadística entre la señal detectada en la etapa (e) y la señal detectada en un control para cada gen usando un algoritmo de transformación de señal,

en el que dicho control se obtiene de acuerdo con un procedimiento que comprende las etapas de:

(i) extraer ARN de tejido cerebral de animales control no humanos entrenados para inducir formación de memoria independiente de la transcripción pero no formación de memoria dependiente de la transcripción asociada a dichos animales control;

(ii) sintetizar sondas de ADN que usan el ARN extraído en la etapa (f) (i); e

(iii) hibridar las sondas de ADN sintetizadas en la etapa (f) (ii) a secuencias de ADN complementarias sobre procesadores de disposiciones que contienen secuencias de ADN de los genes del genoma de los animales control, en el que se produce una señal tras la hibridación de dichas sondas a secuencias de ADN complementarias; y

en el que la formación de memoria en el animal de la etapa (a) se induce usando un protocolo de entrenamiento espaciado y la formación de memoria en los animales control se induce usando un protocolo de entrenamiento en masa; y tanto el protocolo de entrenamiento espaciado como el protocolo de entrenamiento en masa usan procedimientos de condicionamiento pavloviano con un estímulo condicionado y un estímulo no condicionado que están temporalmente emparejados; y

en el que una diferencia estadísticamente significativa entre la la señal detectada en la etapa (e) y la señal detectada en un control para cada gen indica un gen de memoria candidato implicado en la memoria asociativa dependiente de la transcripción.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos animales no humanos son mamíferos no humanos y ARN se extrae del tejido cerebral de dichos mamíferos.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el dicho tejido cerebral es amígdala o hipocampo.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento de condicionamiento Pavloviano es un protocolo de entrenamiento de condicionamiento de miedo contextual.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el protocolo usado para entrenamiento en masa y espaciado induce memoria de una tarea experimental específica.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que procedimiento de condicionamiento Pavloviano es condicionamiento Pavloviano olfativo.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dichos animales no humanos son Drosophila y ARN se extrae de tejido de cabezas de dicha Drosophila.