Método in vitro para identificar compuestos para terapia del cáner.

La presente invención se refiere a un método in vitro para ientificar y evaluar compuestos útiles en el tratamiento de distitos tipos de cáncer, en especial cáncer de pulmón, de mama, colorectal y de vejiga, en un individuo, para determinar el estadio severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar e efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dcho cáncer; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluacin de la eficacia de compuestos para terapia de dicho cáncer, conel fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes qu inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quiasa Alfa y/o los efectos de esta expresión

Método in vitro para identificar compuestos para terapia del cáncer.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para identificar y evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer, especialmente para el cáncer de pulmón, de mama o colorrectal, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, y/o los efectos de esta expresión.

Antecedentes de la invención

La Colina Quinasa (conocida también como CK, CHK y ChoK) es la primera enzima de la ruta de Kennedy o de síntesis de fosfatidilcolina (PC), y fosforila la colina a fosforilcolina (PCho) en presencia de magnesio (Mg²⁺), utilizando adenosina 5'-trifosfato (ATP) como donante de grupos fosfato. La transformación mediada por diversos oncogenes, induce niveles elevados de actividad Colina Quinasa, dando lugar a un incremento anormal en los niveles intracelulares de su producto, PCho, lo que apoya indirectamente el papel de la Colina Quinasa en la generación de tumores humanos. Sin embargo, existen mecanismos alternativos de generación de PCho que no implican la activación de la Colina Quinasa y que podrían explicar los niveles elevados de este metabolito en las células tumorales.

Si bien existe evidencia del incremento de la actividad de la enzima Colina Quinasa en tumores y células transformadas, su relación con el proceso carcinogénico no está suficientemente demostrada al no haberse establecido una clara relación causa-efecto entre el incremento de actividad y la transformación tumoral. Por otra parte, todavía no se ha identificado la molécula responsable de este efecto.

Se han identificado cerca de 200 secuencias génicas que codifican para polipéptidos con estructura primaria homóloga a la Colina Quinasa designadas como Colina Quinasa alfa a, Colina Quinasa alfa b, Colina Quinasa alfa 3, Colina Quinasa beta 1, Colina Quinasa beta 2, Colina Quinasa CKB-1 Colina/etanolamina quinasa Colina Quinasa-like Etanolamina quinasa, Cots, Duff227, Cog3173, CPT1B, SF1,SHOX2, FHOD2, FLJ12242, KRT5,FBL, ARL6IP4, etc. (ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi#219541) tanto en humanos como en otros mamíferos y roedores (rata, ratón, vaca, cobaya, conejo, mono). De hecho, desde 1982 existe evidencia bioquímica de que en diferentes tejidos aislados de rata, ratón y de humanos hay al menos tres isoenzimas con actividad Colina Quinasa que manifiestan propiedades físico-químicas diferentes.

Recientemente, se han identificado en el genoma humano al menos 3 genes que codifican para proteínas con actividad Colina Quinasa demostrada, designados como ck-alfa, ck-beta, y HCEKV (USA Patent US2003186241), y varios genes cuyas proteínas codificadas presentan homología de entre un 30-65% con las codificadas por los genes ck, como por ejemplo los genes CAI16602, CHKL, CAI16600, CAI16599, CAH56371, CAI16603, BAA91793, CAI16598 descritos en (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi), y los genes CPT1B, EKI2, SF1, SHOX2, FHOD2, FLJ12242, KRT5, FBL, ARI61ptextdollar, TOMM40, MLL, descritos en (http://www.ebi.ac.uk/cgi-bin/sumtab?tool=asdblast&jobid=blast-20050412-18072127). Una característica muy relevante de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa es que presentan propiedades bioquímicas diferentes, con importantes variaciones en su afinidad por el substrato colina o por el donante de fosfatos ATP, e incluso en su forma activa, que puede presentarse como dímeros o tetrámeros. Por tanto, es preciso definir si existe una relación directa entre alguna de las diferentes isoenzimas de Colina Quinasa identificadas y la capacidad tumorogénica atribuida por su sobreexpresión en tumores humanos.

Por otra parte, la inhibición de la Colina Quinasa ha demostrado ser una nueva y eficaz estrategia antitumoral en células transformadas por oncogenes, lo que ha sido extrapolado a ratones desnudos in vivo. Recientemente, se ha publicado el aumento de actividad de la Colina Quinasa en diversos carcinomas de mama humanos, y se ha visto que la alteración de la Colina Quinasa es un acontecimiento frecuente en algunos tumores humanos tales como los de pulmón, colorrectales y próstata.

A pesar de la correlación entre unos parámetros y otros, en la actualidad no existe evidencia que establezca de forma fehaciente que la sobreexpresión de Colina Quinasa tiene actividad oncogénica y tumoral en células humanas. Sí existen evidencias que indican que los inhibidores de la actividad colina quinasa, como el hemicolinio-3 [Cuadrado A., Carnero A., Dolfi F., Jiménez B. and Lacal J.C. Oncogene 8, 2959-2968 (1993); Jiménez B., del Peso L., Montaner S., Esteve P. and Lacal J.C. J. Cell Biochem. 57, 141-149 (1995); Hernández-Alcoceba, R., Saniger, L., Campos, J., Núñez, M. C., Khaless, F., Gallo, M. Á., Espinosa, A., Lacal, J. C. Oncogene, 15, 2289-2301 (1997)] o las metilenquinonas de toxicidad reducida descritas en la solicitud de patente española ES200503263, presentan actividad antitumorogénica. Sin embargo, no existe en los mencionados documentos ni el resto de la técnica anterior evidencia concluyente de cuál de las diversas isoenzimas con actividad Colina Quinasa demostrada (ck-alfa, ck-beta, HCEKV, etc) e identificadas en tejidos humanos podría ser la responsable de la actividad enzimática detectada, ni de cuál de las isoenzimas es sensible a la inhibición por los inhibidores que han mostrado actividad antitumoral. Esta identificación es necesaria para poder establecer su potencial utilización como diana terapéutica en cáncer.

Objeto de la invención

Aquí es divulgado un método in vitro para buscar, identificar y evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer, en especial para el cáncer de pulmón, mama o colorrectal.

Es además divulgado el uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen colina quinasa alfa en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal.

Una divulgación adicional consiste en proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína Colina Quinasa Alfa, para el tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal.

Es también divulgado una composición farmacéutica que comprenda uno o varios agentes terapéuticos junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento del cáncer, preferiblemente del cáncer de pulmón, de mama o colorrectal.

Es divulgado además un método in vitro de monitorización del efecto de una terapia administrada a un paciente de cáncer, caracterizado porque la evaluación del nivel de expresión de la proteína colina quinasa alfa en una muestra de tejido extraída del paciente al que se está suministrando un agente anti-tumoral, preferiblemente un agente según las reivindicaciones 3-5, mediante la determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína colina quinasa alfa que se selecciona entre el nivel de su ARN mensajero, la concentración de dicha proteína o su actividad enzimática, y la comparación del valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal no canceroso.

Por último, es también divulgado un kit de diagnóstico para llevar a cabo la presente invención.

Descripción de las figuras

Figura 1: A) Actividad Colina Quinasa (ChoK) en extractos de células humanas Hek293T (Human embryonic kidney cells) tras sobre-expresar Colina Quinasa Alfa y Beta (ensayo de actividad colina quinasa ex vivo). B) Niveles intracelulares de fosforilcolina en las células vivas (ensayo de actividad Colina Quinasa in vitro).

Figura 2: A) Actividad ChoK en células humanas Chok293T tras sobre-expresar Colina Quinasa Alfa y Beta. B) Especificidad de los anticuerpos monoclonales generados frente a Colina Quinasa Alfa en los mismos extractos que se muestran en A.

Figura 3: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en NSCLC (Non-small cell lung cancer).

Figura 4: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en cáncer de mama.

Figura 5: Sobreexpresión de Colina Quinasa Alfa determinada mediante técnicas inmunohistoquímicas en cáncer de colon. B) Pólipo en el que se observa la tinción...

1. Un método in vitro para determinar el pronóstico de un paciente con cáncer que comprende la evaluación del nivel de expresión de la proteína Colina Quinasa Alfa en una muestra de tejido canceroso extraído de un paciente mediante la determinación en dicha muestra de al menos un parámetro relacionado con la proteína Colina Quinasa Alfa seleccionado del nivel de su ARN mensajero y la concentración de dicha proteína, y la comparación del valor obtenido con el valor correspondiente a una o más muestras de tejido normal no-canceroso.

2. El método de la reivindicación 1, en donde se determina el pronóstico de un paciente con cáncer de pulmón o vejiga.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el nivel de ARN mensajero es determinado mediante la amplificación del ARN mensajero presente en el extracto de ARN total y cuantificación de la amplificación del producto de ARNm.

4. El método de la reivindicación 3, el cual es llevado a cabo mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

5. El método según una o más reivindicaciones anteriores, en donde se diagnostica el tiempo de supervivencia de un paciente.