ENSAYO GENÉRICO DE DETECCIÓN DE ACTIVIDAD QUINASA/FOSFATASA CON UNA ÚNICA LECTURA.

Ensayo genérico de detección de actividad quinasa/fosfatasa con una única lectura La presente invención se refiere a un ensayo genérico para detectar la actividad quinasa o fosfatasa y su utilización en las ciencias de la vida y en el descubrimiento de fármacos. Durante los últimos años se han desarrollado varios métodos para la detección de la fosforilación (actividad quinasa) o desfosforilación (actividad fosfatasa) de péptidos o proteínas para su utilización en la farmacología in vitro y cribado de alto rendimiento (HTS). Lo más atractivo de estas aplicaciones son los métodos de detección de marcajes fluorescentes que son, ensayos de mezclar y leer homogéneos y que son los adecuados para la miniaturización. Los ensayos más comunes se basan en la unión de un anticuerpo específico al grupo fosfato, no obstante los ensayos basados en anticuerpos no son genéricos ya que los anticuerpos para la fosfoserina o fosfotreonina son específicos de secuencia. Los ensayos basados en la afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAP) están libres de anticuerpos y de esta manera son genéricos. WO 2007/016975 describe un ensayo FRET quinasa y fosfatasa que consiste en tres partes: una pareja de unión, una molécula de detección que está marcada con un donador o un aceptor de una pareja de FRET y una molécula de sustrato que está marcada con un donador o un aceptor de la pareja de FRET. La unión de la molécula de detección y la molécula de sustrato fosforilado en la superficie de la pareja de unión resulta en una señal FRET detectable. La WO 2006/102129 describe un ensayo para la detección de sustratos fosforilados y defosforilados que utilizan polímeros fluorescentes recubiertos, cuentas catiónicas y una molécula de sustrato que comprende un segundo fluoróforo que actúa como bloqueador del polímero fluorescente inmovilizado sobre las cuentas catiónicas. Este ensayo consiste de dos entidades moleculares: a) microesferas catiónicas recubiertas con un fluoróforo y b) una molécula de sustrato que comprende un fluoróforo. La entidad de bloqueo es un colorante de transferencia de energía o de transferencia de electrones, por ejemplo una tinción fluorescente como BODIPY TMR, y el fluoróforo es un polímero fluorescente. Otro ensayo genérico para la detección de una actividad quinasa es el ensayo Transcreener en el que se mide la producción de ADP. En todos estos ensayos la detección de actividad quinasa/ fosfatasa está basada en la polarización de la fluorescencia (FP) o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, TR-FRET, HTRF). Estas medidas de fluorescencia, no obstante, requieren de múltiples lecturas de diferentes parámetros ópticos como polarización, longitudes de onda, detección retrasada en el tiempo, que requiere una instrumentación más sofisticada que una simple medida de intensidad de fluorescencia. Los ensayos ADP son solo adecuados para altas concentraciones de ATP/ ADP y un alto recambio de la enzima y uno podría salirse fácilmente del rango lineal de la reacción. Además la detección es solo indirecta, ya que el consumo de ATP/ ADP monitorizado puede no ser específico y no la (de)fosforilación del sustrato de la fosfatasa o quinasa específica. Por lo tanto, existe una necesidad para un ensayo quinasa y fosfatasa genérico mejorado permitiendo una detección eficiente de la actividad quinasa o fosfatasa. Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para detectar una actividad quinasa o fosfatasa que cumpla este requisito mediante una lectura de fluorescencia robusta y fiable. Este método comprende los siguientes pasos: a) incubar una muestra de actividad quinasa o fosfatasa con una molécula de sustrato quinasa o fosfatasa que comprende un fluoróforo que posee un marcador detectable, b) incubar la mezcla del paso a) con una entidad de detección que comprende un grupo aromático que se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos triptófano, tirosina y fenilalanina, y una pareja de unión, en el que ambas moléculas de sustrato fosforilado y la entidad de detección son capaces de unirse a la pareja de unión y la unión de la molécula de sustrato y la entidad de detección a la pareja de unión conduce a una lectura alterada del fluoróforo, en el que la lectura alterada del fluoróforo se debe a un bloqueo estático o dinámico que resulta de la interacción directa de los orbitales moleculares del fluoróforo de la molécula sustrato y el grupo aromático de la entidad de detección, y c) medir la lectura del fluoróforo en la mezcla del paso b), en el que una lectura alterada del fluoróforo comparado con un blanco es indicativo de la presencia de una actividad quinasa o fosfatasa en la muestra. En un segundo objeto, la presente invención está dirigida a un método para detectar una actividad quinasa o actividad fosfatasa. Dicho método comprende los siguientes pasos: 2   a) incubar una muestra de actividad quinasa o fosfatasa con una molécula sustrato que comprende un grupo aromático que se selecciona del grupo que consiste en los aminoácidos triptófano, tirosina y fenilalanina, b) incubar la mezcla del paso a) con una entidad de detección que comprende un fluoróforo que posee un marcador detectable, y una pareja de unión, en el que ambas moléculas de sustrato fosforilado y la entidad de detección puede unirse a la pareja de unión y la unión de la molécula sustrato y la entidad de detección a la pareja de unión conduce a una lectura alterada del fluoróforo, en la que la lectura alterada del fluoróforo se debe a un bloqueo estático o dinámico que resulta de la interacción directa de los orbitales moleculares del fluoróforo de la entidad de detección y el grupo aromático de la molécula sustrato, y c) medir la lectura del fluoróforo en la mezcla del paso b), en el que una lectura alterada del fluoróforo comparado con un blanco es indicativo de la presencia de una actividad quinasa o fosfatasa en la muestra. En una realización de la presente invención, el fluoróforo se selecciona de entre el grupo que consiste en Fluoresceína, Rodamina B, Tetrametilrodamina, ATTO 590, ATTO 655, ATTO 680, Atto 700, MR 121, Bodipy 630/650 y Bodipy FL. Los fluoróforos preferibles se seleccionan de entre el grupo que consiste en MR 121, ATTO 590, ATTO 655, Atto 680 y ATTO 700. Los fluoróforos particularmente preferibles para utilizar en un método de la presente invención son MR 121 y Atto 700. Las estructuras moleculares de algunos de estos fluoróforos pueden encontrarse en Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1133-1139. Las moléculas ATTO están comercialmente disponibles de Atto-Tec GmbH, Siegen, Alemania. En una realización de la presente invención el grupo aromático es triptófano. En otra realización de la presente invención la unión de la molécula sustrato y la entidad de detección a la pareja de unión involucran interacciones iónicas. En otra realización de la presente invención la pareja de unión se selecciona a partir de iones metálicos de ácidos de Lewis duros o sólidos como cuentas con iones en su superficie. En otra realización de la presente invención la entidad de detección es un péptido que comprende fosfotirosina y/o fosfoserina y/o fosfotreonina. En otra realización de la presente invención la molécula sustrato es un péptido que comprende al menos una tirosina y/o serina y/o treonina. En otra realización de la presente invención el método es para detectar una actividad tirosina quinasa y el péptido sustrato comprende al menos una tirosina. En otra realización de la presente invención el método es para detectar una actividad serina quinasa y el péptido sustrato comprende al menos una serina. En otra realización de la presente invención el método es para detectar una actividad treonina quinasa y el péptido sustrato comprende al menos una treonina. En otra realización de la presente invención el método es para detectar una actividad fosfatasa y la molécula sustrato es un péptido que comprende grupos fosfato, preferiblemente fosfotirosina o fosfoserina o fosfotreonina. En otra realización de la presente invención la lectura del fluoróforo es la intensidad de fluorescencia. Descripción detallada de la invención El término "actividad quinasa" tal como se utiliza aquí se refiere a una fosforilación de un sustrato mediante una quinasa. El término "actividad fosfatasa" tal como se utiliza aquí se refiere a una defosforilación de un sustrato mediante una fosfatasa. Tal como se utiliza aquí "fluoróforo" se refiere a un componente de una molécula que provoca que una molécula sea fluorescente. Es un grupo funcional en una molécula que absorberá energía de una longitud de onda específica y reemite energía en una longitud de onda diferente (pero igualmente específica). El término "molécula sustrato" tal como se utiliza aquí se refiere... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar una actividad quinasa o actividad fosfatasa que comprende los pasos: a) incubar una muestra con actividad quinasa o fosfatasa con una molécula sustrato quinasa o fosfatasa que comprende un fluoróforo con un marcaje detectable, b) incubar la mezcla del paso a) con una entidad de detección que comprende un grupo aromático que se selecciona de entre el grupo que consiste en los aminoácidos triptófano, tirosina y fenilalanina, y una pareja de unión, en la que ambas molécula de sustrato fosforilado y la entidad de detección son capaces de unirse a la pareja de unión y la unión de la molécula sustrato y la entidad de detección a la pareja de unión conduce a una lectura alterada del fluoróforo, en el que la lectura alterada del fluoróforo se debe al bloqueo estático o dinámico que resulta de la interacción directa de orbitales moleculares del fluoróforo de la molécula sustrato y el grupo aromático de la entidad de detección, y c) medir el marcaje del fluoróforo en la mezcla del paso b), en el que una lectura alterada del fluoróforo en comparación con el blanco es indicativo de la presencia de una actividad quinasa o fosfatasa en la muestra. 2. Un método para detectar una actividad quinasa o actividad fosfatasa que comprende los pasos: a) incubar una muestra con actividad quinasa o fosfatasa con una molécula sustrato que comprende un grupo aromático que se selecciona de entre el grupo que consiste en los aminoácidos triptófano, tirosina y fenilalanina, b) incubar la mezcla del paso a) con una entidad de detección que comprende un fluoróforo con un marcaje detectable, y una pareja de unión, en la que ambas molécula de sustrato fosforilado y la entidad de detección pueden unirse a la pareja de unión y la unión de la molécula sustrato y la entidad de detección a la pareja de unión conduce a una lectura alterada del fluoróforo, en la que la lectura alterada del fluoróforo se debe a un bloqueo estático o dinámico que resulta de la interacción directa de orbitales moleculares del fluoróforo de la entidad de detección y el grupo aromático de la molécula de sustrato, y c) medir el marcaje del fluoróforo en la mezcla del paso b), en el que una lectura alterada del fluoróforo en comparación con el blanco es indicativo de la presencia de una actividad quinasa o fosfatasa en la muestra. 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el fluoróforo se selecciona de entre el grupo que consiste en Fluoresceína, Rodaminea B, TMR, ATTO 590, ATTO 655, ATTO 680, Atto 700, MR 121, Bodipy 630/650 y Bodipy FL, más preferiblemente del grupo que consiste en ATTO 590, ATTO 655, ATTO 680, Atto 700 y MR 121. 4. El método molecular de la reivindicación 3, en el que el fluoróforo es MR 121 o Atto 700. 5. El método de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el grupo aromático es triptófano. 6. El método de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la unión de la molécula sustrato y la entidad de detección a la pareja de unión involucra interacciones iónicas. 7. El método de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el pareja de unión se selecciona de iones metálicos de ácidos de Lewis duros o sólidos como cuentas con iones en su superficie. 8. El método de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la entidad de detección es un péptido que comprende fosfotirosina y/o fosfoserina y/o fosfotreonina. 9. El método de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la molécula sustrato es un péptido que comprende al menos una tirosina y/o serina y/o treonina. 10. El método de la reivindicación 9, en el que el método es para detectar a tirosina quinasa actividad y el péptido sustrato comprende al menos una tirosina. 11. El método de la reivindicación 9, en el que el método es para detectar a serina quinasa actividad y el péptido sustrato comprende al menos una serina. 12. El método de la reivindicación 9, en el que el método es para detectar una actividad treonina quinasa y el péptido sustrato comprende al menos una treonina. 7   13. El método de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el método es para detectar una actividad fosfatasa y la molécula sustrato es un péptido que comprende grupos fosfato, preferiblemente fosfotirosina o fosfoserina o fosfotreonina. 14. El método de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la lectura del fluoróforo es la intensidad de fluorescencia. 8   Figura 1 Quinasa 9 Pareja de unión Entidad de detección Pareja de unión     11   12   13