INDICADOR BIOLÓGICO.

[0001] La invención se refiere a un indicador biológico adecuado para la validación de procesos, incluyendo procesos de inactivación por calor y procedimientos de inactivación en general y, más específicamente, para la validación de procedimientos para inactivar agentes de la encefalopatía espongiforme transmisible (EET). [0002] La enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ) es una forma relativamente rara de enfermedad neurodegenerativa humana que se presenta como una enfermedad familiar, esporádica o yatrogénica con una frecuencia de aproximadamente 1 caso por millón de personas. La aparición de una nueva forma variante (ECJv) de la enfermedad, predominantemente en un grupo de edad más joven y posiblemente debido al consumo de productos cárnicos infectados con encefalopatía espongiforme bovina (EEB) ha hecho surgir la posibilidad de un gran aumento en el número de casos. Estos factores tienen importantes consecuencias para la salud pública. Al final de la década de los años ochenta, una gran proporción de la población de Reino Unido estuvo potencialmente expuesta a la enfermedad a través de la comida. Mientras que el número de casos hasta la fecha ha sido relativamente bajo (149 casos hasta febrero de 2004) sigue habiendo un riesgo significativo para todas las formas de ECJ, a través de otras vías de transmisión como cirugía, trasplantes, transfusión o productos médicos contaminados. Varias de estas vías se han visto implicadas en la expansión yatrogénica de la enfermedad en un ámbito clínico y otras se han identificado en modelos animales. [0003] Los agentes responsables causantes de todas las formas de ECJ en humanos son muy resistentes a la inactivación mediante procedimientos convencionales. Se requieren urgentemente procedimientos validados para la descontaminación de instrumental quirúrgico. Se han probado diversos tratamientos, incluyendo tratamientos químicos y el uso de temperaturas y presiones altas con calor húmedo o seco, pero ninguno de ellos es adecuado [Taylor, D.M. (1999) en: Principles and practice of disinfection, preservation and sterilisation. (Russell, A.D., Hugo, W.B. y Ayliffe, G.A.J., Eds): págs. 222-236 Blackwell Scientific Publications, Oxford; Taylor, D.M. (2001) Contrib Microbiol. 7, 58-67; Taylor, D.M., Fernie, K, Steele, P.J., McConnell, I. y Somerville, R.A. (2002) J Gen Virol. 83, 3199-3294]. La incineración es eficaz, pero impide cualquier recuperación o reutilización de las materias primas o del equipo. El uso de altas concentraciones de hidróxido sódico (hasta 2M) o de niveles altos de hipoclorito sódico (hasta 20.000 ppm) ha mostrado una reducción significativa de los niveles de agentes de EET, aunque tiene un efecto perjudicial sobre el instrumental quirúrgico y puede ser peligroso para el operador. Se ha propuesto una amplia variedad de otros procedimientos, como medios para inactivar los agentes de EET en los instrumentos quirúrgicos y están actualmente en desarrollo. Entre estos se incluyen diversos esterilizantes en fase gaseosa como peróxido de hidrógeno, ozono y óxido de etileno en fase de vapor. Se han propuesto otros procedimientos como un pretratamiento específico anti-EET previo a la esterilización de rutina y entre estos se incluye el tratamiento del instrumental quirúrgico usando proteasas termoestables en condiciones definidas de pH y temperatura. [0004] La inactivación de las esporas de Bacillus stearothermophilus es un procedimiento de rutina utilizado para 35 validar el correcto funcionamiento de los autoclaves. Estos indicadores pueden representar una indicación importante de que una bacteria o un virus han sido inactivados por el proceso, con el proceso validado normalmente por la reducción del nivel de agente infeccioso en una magnitud de 10 6 . Sin embargo, las propiedades excepcionalmente estables de los agentes de EET significa que se requiere un indicador mucho más fuerte para proporcionar una indicación relevante de la realización de los procesos para inactivar dichos agentes. 40 [0005] Otros indicadores biológicos, basados en esporas o preparaciones enzimáticas termoestables son bien conocidos por los expertos en la materia. Todos tienen el inconveniente de que no permiten validar la inactivación de un agente infeccioso en exceso de una reducción de la actividad de 10 6 .   [0006] La inactivación de los agentes de EET también supone un problema significativo para la eliminación de los materiales infecciosos de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y para la preparación de las materias primas de origen animal. Existe en la actualidad un gran número de indicios científicos de que la aparición y expansión de la EEB se produjeron a través de los cambios en la generalización de la práctica de alimentar al ganado con tejidos neuronales altamente infecciosos a través de suplementos alimenticios de harina de carne y huesos. Existen también indicios válidos de que la EEB era la causa de la ECJv, prácticamente con toda seguridad, como resultado de comer productos cárnicos contaminados. Por este motivo, actualmente si cualquier res muere por EEB, se retira de la cadena alimenticia la médula espinal y el tejido cerebral de todos los animales y se eliminan mediante una vía alternativa. Esto tiene como resultado que cantidades enormes de residuos animales están actualmente siendo acumulados o eliminados mediante incineración. El tratamiento de este material con proteasas termoestables es una posible solución. De nuevo existe la necesidad de un procedimiento de validación para garantizar que se destruye todo el material infeccioso en un proceso apropiado. 55 [0007] En el documento WO2004/003226 se describe un dispositivo de control a base de enzimas para el procesado térmico de objetos. 2 [0008] En el documento WO 00/46357 se describe un ensayo con fondo reducido. [0009] En el documento US 4584272 se describe la adenilato cinasa y un proceso para la producción de la misma. [0010] Michel PE y col., Analytica Chimica Acta, 360(1-3), 10 de marzo de 1998, páginas 89-99, describen una inhibición enzimática transitoria como herramienta eficaz para el análisis bioluminiscente discriminatorio de tres nucleótidos adenílicos basado en una capa sensible trienzimática compartimentalizada. [0011] En Aflalo C y col., Biochemistry, 26(13), 1987; páginas 3913-3920 se describe el control continuo de ATP en el microentorno de enzimas inmovilizadas mediante la luciferasa de luciérnaga. [0012] En el documento WO 02/053723 se describe un procedimiento para la inactivación de la EET. [0013] Es un objeto de la presente invención proporcionar un indicador biológico alternativo y/o mejorado y los usos del mismo. [0014] En su sentido más amplio, la presente invención proporciona el uso de una adenilato cinasa termoestable trimérica o monomérica como indicador para validar un proceso de tratamiento, un indicador de un proceso biológico, un kit, un kit portátil, un procedimiento para validar un proceso de tratamiento y un procedimiento para correlacionar la reducción de la cantidad o actividad de un agente contaminante en una muestra, como se define en las reivindicaciones adjuntas. [0015] Por consiguiente, en un primer aspecto de la invención, se proporciona un indicador de un proceso biológico como se define en las reivindicaciones para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un agente biológico en una muestra, que comprende una cinasa. El indicador además comprende un soporte sólido como se define en las reivindicaciones, en el que la cinasa está inmovilizada en o sobre dicho soporte sólido. La cinasa es una cinasa termoestable como se define en las reivindicaciones. [0016] En un uso de la invención, se incluye un indicador biológico como se define en las reivindicaciones en una muestra que está siendo sometida a un tratamiento que pretende reducir su contenido de un posible contaminante, especialmente un agente infeccioso. A partir de pruebas previas, se sabe que la reducción de la actividad de la cinasa indicadora mediante el tratamiento puede estar correlacionada con la reducción en la cantidad o actividad del contaminante. Para determinar si la cantidad/actividad del contaminante se ha reducido por debajo de un nivel aceptable, la actividad de la cinasa indicadora se mide antes y después, o durante el tratamiento. Cuando se alcanza un nivel de actividad que se sabe está correlacionado con una reducción aceptable del contaminante, entonces el tratamiento se considera validado. Si el contaminante es un agente infeccioso, entonces la muestra puede considerarse estéril. 30 [0017] En un uso particular de la invención, una cinasa termoestable como se define en las reivindicaciones es el indicador en un procedimiento indicativo de la posible presencia de un agente (p. ej. un agente infeccioso) tras un procedimiento de limpieza o inactivación. En... [Seguir leyendo]

1. Uso de una cinasa termoestable como indicador para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un agente biológico contaminante en una muestra; en el que la cinasa termoestable es una adenilato cinasa trimérica o una adenilato cinasa monomérica que retiene al menos el 95% de la actividad tras la exposición a 70ºC durante 30 minutos. en el que el proceso de tratamiento comprende la exposición a uno o más entre un pH, presión, enzima, detergente, esterilizante químico, esterilizante en fase gaseosa seleccionado, o el autoclavado a alta temperatura con vapor húmedo o seco, donde el proceso de tratamiento se lleva a cabo en presencia de una cantidad definida de la cinasa termoestable, y 10 en el que el agente biológico se selecciona entre el grupo compuesto por bacterias, virus, esporas, proteínas, péptidos y priones. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que la cinasa cataliza la formación de ATP a partir de un sustrato que comprende ADP. 3. Uso según la reivindicación 1 o 2, en el que la cinasa retiene al menos el 95% de la actividad tras la exposición a 80ºC durante 10 minutos. 4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que la cinasa es una adenilato cinasa trimérica de Sulfolobus sp. o una adenilato cinasa monomérica de Thermotoga sp. 5. Uso según las reivindicaciones 1 o 2 en el que la cinasa es una adenilato cinasa de A. acidocaldarius, A. fulgidus, A. pernix, A. pyrophilus, B. caldotenax BT1, especies de Bacillus PS3, B. stearothermophilus 11057, B. stearothermophilus 12001, B. thermocatenulatus, C. stercocorarium, Methanococcus spp., M. ruber, P. abyssi, P. furiosus, P. horikoshii, P. woesii, R. marinus, S. acidocaldarius, S. shibatae, S. solfataricus, T. ethanolicus, T. thermosulfurogenes, T. celere, T. litoralis, T. aquaticus YT1, T. caldophilus GK24, T. thermophilus HB8, T. maritima o T. neapolitana. 6. Uso según la reivindicación 5, en el que la cinasa es una cinasa de T. litoralis, cinasa de T. maritima o cinasa de T. neapolitana. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la cinasa está inmovilizada o se inmoviliza sobre un soporte sólido. 8. Uso según la reivindicación 7, en el que el soporte sólido es una matriz y la cinasa se dispersa dentro de la matriz. 9. Uso según la reivindicación 8, en el que el soporte sólido comprende una matriz polimérica. 10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que el soporte sólido es una tira indicadora, una tira reactiva o una perla. 11. Uso según cualquier de las reivindicaciones precedentes, en el que el indicador además comprende un agente para estabilizar la cinasa. 35 12. Uso según la reivindicación 11, en el que el agente estabilizante se selecciona entre iones metálicos, azúcares, alcoholes de azúcar y agentes gelificantes.   13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7-12, que además comprende un sistema para unir el soporte a una superficie. 14. Uso según la reivindicación 13, que comprende una proyección, hueco o rendija para la unión del soporte a una superficie mediante una tuerca, un tornillo y un perno o una abrazadera. 15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el agente biológico es encefalopatía espongiforme transmisible. 16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el proceso de tratamiento comprende uno o más entre temperatura alta, pH alto, presión alta o exposición a una proteasa. 45 17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el proceso de tratamiento comprende exponer la muestra a una proteasa termoestable a una temperatura de al menos 60ºC y a un pH de al 72 menos 9. 18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cinasa tiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº. 1-19 o está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº. 26-30. 5 19. Un indicador de un proceso biológico para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un agente biológico contaminante en una muestra, que comprende: a) una cinasa termoestable que retiene al menos el 95% de la actividad tras la exposición a 70ºC durante 30 minutos, en el que la cinasa es una adenilato cinasa trimérica o una adenilato cinasa monomérica y b) un soporte sólido seleccionado entre el grupo compuesto por: i) una tira indicadora, una tira reactiva 10 o una perla, donde la cinasa está inmovilizada dentro del soporte sólido o se conjuga covalentemente sobre el soporte sólido o ii) una matriz, en la que la cinasa se dispersa dentro de dicha matriz. 20. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 19, en el que la cinasa retiene al menos el 95% de la actividad tras la exposición a 80ºC durante 10 minutos. 21. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 19 o 20, en el que la cinasa es una adenilato cinasa trimérica de Sulfolobus sp. o una adenilato cinasa monomérica de Thermotoga sp. 22. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 19 o 20 en el que la cinasa es una adenilato cinasa de A. acidocaldarius, A. fulgidus, A. pernix, A. pyrophilus, B. caldotenax BT1, especies de Bacillus PS3, B. stearothermophilus 11057, B. stearothermophilus 12001, B. thermocatenulatus, C. stercocorarium, Methanococcus spp., M. ruber, P. abyssi, P. furiosus, P. horikoshii, P. woesii, R. marinus, S. acidocaldarius, S. shibatae, S. solfataricus, T. ethanolicus, T. thermosulfurogenes, T. celere, T. litoralis, T. aquaticus YT1, T. caldophilus GK24, T. thermophilus HB8, T. maritima o T. neapolitana. 23. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 22, en el que la cinasa es una cinasa de T. litoralis, cinasa de T. maritima o cinasa de T. neapolitana. 24. Un indicador de un proceso biológico según cualquier de las reivindicaciones 19 a 23, en el que la cinasa cataliza la formación de ATP a partir de un sustrato que comprende ADP. 25. Un indicador de un proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 19-24, en el que el soporte sólido es una matriz y la cinasa se dispersa dentro de la matriz. 26. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 25, en el que el soporte comprende una matriz polimérica. 30 27. Un indicador de un proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 19-24, en el que el soporte es una tira indicadora, una tira reactiva o una perla.   28. Un indicador de un proceso biológico según cualquier de las reivindicaciones 19-27, que además comprende un agente para estabilizar la cinasa. 29. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 28, en el que el agente estabilizante se selecciona entre iones metálicos, azúcares, alcoholes de azúcar y agentes gelificantes. 30. Un indicador de un proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 19-29, que además comprende un sistema para unir el indicador a una superficie. 31. Un indicador de un proceso biológico según la reivindicación 30, que comprende una proyección, hueco o rendija para la unión del indicador a una superficie mediante una tuerca, un tornillo y un perno o una abrazadera. 32. Un kit usado para validar un proceso de tratamiento para reducir la cantidad o actividad de un agente biológico en una muestra, que comprende: i) un indicador de un proceso biológico según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 31 y ii) un sustrato para la cinasa. 33. Un kit según la reivindicación 32, que además comprende sistemas para detectar ATP. 73 34. Un kit según la reivindicación 33, que además comprende un sistema luciferina/luciferasa. 35. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 32-34, que además comprende un luminómetro. 36. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 32-35, que además comprende una tabla de consulta que correlaciona la actividad cinasa del indicador con la reducción en la cantidad o actividad del agente biológico. 37. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 32-36, para controlar la inactivación de la EET. 38. Un kit portátil según cualquiera de las reivindicaciones 32-37. 39. Un procedimiento para validar un proceso de tratamiento que comprende: i) obtener una muestra que contiene, o se sospecha que contiene, un agente biológico contaminante en el que el agente biológico se selecciona entre el grupo compuesto por bacterias, virus, esporas, proteínas, péptidos y priones; ii) someter la muestra a un tratamiento que comprende exponer a uno o más de un pH, presión, enzima, detergente, esterilizante químico, esterilizante en fase gaseosa seleccionado, o autoclavado a alta temperatura con vapor húmedo o seco, en presencia de una cantidad definida de una cinasa termoestable, en el que la cinasa termoestable es una adenilato cinasa trimérica o una adenilato cinasa monomérica que retiene al menos el 95% de la actividad tras la exposición a 70ºC durante 30 minutos; en el que el tratamiento reduce la cantidad o actividad del agente biológico; y iii) determinar la actividad cinasa residual y, opcionalmente, calcular la reducción en la actividad cinasa iv) comparar dicha actividad residual con una actividad cinasa predeterminada, en el que la actividad 20 cinasa predeterminada se corresponde con una reducción confirmada en la cantidad o actividad del agente biológico en las mismas condiciones de tratamiento. 40. Un procedimiento según la reivindicación 39, en el que la cinasa retiene al menos el 95% de la actividad tras la exposición a 80ºC durante 10 minutos. 41. Un procedimiento según la reivindicación 39 o 40, en el que la adenilato cinasa es una adenilato cinasa trimérica de Sulfolobus sp. o una adenilato cinasa monomérica de Thermotoga sp. 42. Un procedimiento según las reivindicaciones 39-41 en el que la cinasa es una adenilato cinasa de A. acidocaldarius, A. fulgidus, A. pernix, A. pyrophilus, B. caldotenax BT1, especies de Bacillus PS3, B. stearothermophilus 11057, B. stearothermophilus 12001, B. thermocatenulatus, C. stercocorarium, Methanococcus spp., M. ruber, P. abyssi, P. furiosus, P. horikoshii, P. woesii, R. marinus, S. acidocaldarius, S. shibatae, S. solfataricus, T. ethanolicus, T. thermosulfurogenes, T. celere, T. litoralis, T. aquaticus YT1, T. caldophilus GK24, T. thermophilus HB8, T. maritima o T. neapolitana. 43. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-42, en el que la cinasa es una cinasa de T. litoralis, cinasa de T. maritima o cinasa de T. neapolitana. 44. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-43, en el que la cinasa tiene una 35 secuencia de aminoácidos que se selecciona entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº. 1-19 o está codificado por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº. 26-30.   45. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-44, en el que se sabe que la muestra contiene el agente biológico. 46. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-45, en el que el agente biológico es una encefalopatía espongiforme transmisible. 47. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-45, en el que el tratamiento comprende uno o más entre temperatura alta, pH alto, presión alta o exposición a una proteasa. 48. Un procedimiento según la reivindicación 47, en el que el tratamiento comprende exponer la muestra a una proteasa termoestable a una temperatura en el intervalo de 50-120ºC. 45 49. Un procedimiento según la reivindicación 48, en el que el tratamiento comprende exponer la muestra a la proteasa a una temperatura de 60ºC o superior. 74 50. Un procedimiento según la reivindicación 49, que comprende exponer la muestra a la proteasa a un pH de 9 o superior. 51. Un procedimiento según cualquiera de la reivindicaciones 39-50, en el que la cinasa, antes del tratamiento, tiene una actividad de al menos 500.000 Unidades relativas de luz por mg de cinasa cuando se mide en presencia del sistema luciferina/luciferasa usando un luminómetro. 52. Un procedimiento según la reivindicación 51, en el que la actividad cinasa predeterminada es menos de 10.000 unidades relativas de luz por mg de cinasa cuando se mide en presencia del sistema luciferina/luciferasa mediante un luminómetro. 53. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-52, en el que la reducción predeterminada en la actividad cinasa es igual o mayor a una reducción de 6 log. 54. Un procedimiento según la reivindicación 53, en el que la reducción predeterminada en la actividad cinasa se corresponde con una reducción de al menos 6 log en la cantidad o concentración de cinasa. 55. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-54, en el que la reducción predeterminada en la actividad cinasa se corresponde con una reducción de las unidades relativas de luz de al menos 900.000 URL. 56. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-55, en el que la reducción confirmada en la cantidad o actividad del agente biológico es una reducción de al menos 6 log. 57. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-56, que comprende medir la actividad cinasa antes de tratar la muestra y después de tratar la muestra. 20 58. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-57, que comprende tratar la muestra a 80ºC durante al menos 10 minutos antes de medir la actividad residual de la cinasa. 59. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-58, en el que medir la actividad residual de la cinasa comprende añadir un sustrato que comprende ADP a la cinasa residual y medir la formación de ATP. 60. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 39-59, que comprende continuar el 25 tratamiento hasta que la actividad residual de la cinasa o la reducción en la actividad cinasa se corresponde con una reducción confirmada en la cantidad o actividad del agente biológico de al menos 6 log.   61. Un procedimiento para correlacionar la reducción en la cantidad o actividad de un agente biológico contaminante en una muestra, en el que el agente biológico se selecciona entre el grupo compuesto por bacterias, virus, esporas, proteínas, péptidos y priones, con la actividad cinasa termoestable de un indicador según cualquiera de las reivindicaciones 19-31, que comprende: i) preparar una muestra que contiene una cantidad definida del agente biológico y una muestra que contiene una cantidad definida de la cinasa; ii) someter a las muestras a un tratamiento que comprende exponer a uno o más de entre un pH, presión, enzima, detergente, esterilizante químico, esterilizante en fase gaseosa seleccionado, o autoclavado a alta temperatura con vapor húmedo o seco; iii) medir la actividad residual de la cinasa; iv) medir la cantidad o actividad residual del agente biológico y, opcionalmente, calcular la reducción en la cantidad o actividad del agente biológico y v) repetir los pasos i) a iv), en el que se cambia al menos uno de los parámetros de tratamiento. 62. Un procedimiento según la reivindicación 61, en el que el agente biológico es una encefalopatía espongiforme transmisible. 63. Un procedimiento según las reivindicaciones 61 o 62, en el que el parámetro de tratamiento comprende uno o más entre tiempo, proteasa, concentración y concentración de esterilizante o detergente. 64. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 61-63, en el que: el tratamiento comprende calentar la muestra (o muestras) a una temperatura de entre 50-140ºC. el parámetro de tratamiento es el tiempo;   y en el que los pasos i) a iv) se repiten sometiendo a la muestra (o muestras) a dicho tratamiento durante periodos de 1, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos. 65. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 61-64, en el que: el tratamiento comprende exponer la muestra(o muestras) a un pH de 9-14; el parámetro de tratamiento es el tiempo; y en el que los pasos i) a iv) se repiten sometiendo a la muestra (o muestras) a dicho tratamiento durante periodos de 1, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos. 66. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 61-65, en el que: 0,5-2 mg/ml; el tratamiento comprende exponer la muestra (o muestras) a una proteasa a una concentración de el parámetro de tratamiento es el tiempo; y en el que los pasos i) a iv) se repiten sometiendo a la muestra (o muestras) a dicho tratamiento durante periodos de 1, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos. 76   77   78   79     81   82   83   84