Anticuerpo monoclonal modificado anti-TNF alfa derivado del anticuerpo quimérico infliximab que es sustancialmente no inmunogénico o menos inmunogénico en el hombre que el AcMo cA2 (infliximab) cuando se usa in vivo,

y que comprende alteraciones de restos aminoacídicos específicos en la región V de sus cadenas ligera y pesada en comparación con el AcMo cA2, en el que dichas alteraciones están en la región V de la cadena pesada:

en el que dichas alteraciones están en la región V de la cadena pesada:

M18L, K19R, V23A, I28T, I51T, I56T, S79N, A80S, V81L, T86N, D87S, R89K, L116V

y en la región V de la cadena ligera:

L3Q, A9D, I10T, L11S, V13A, V19A, Q38H, R39T, I58V, S74T, T77S, V78L, S80A, I83A, D85T;

donde dichas alteraciones causan una reducción o eliminación del número de secuencias peptídicas dentro de dichas regiones V, que actúan en el AcMo cA2 como ligandos de unión a MHC de clase II y estimulan a las células T en el hombre

Anticuerpo modificado anti-TNF alfa.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos para administrar especialmente a humanos y, en particular, para uso terapéutico. Los polipéptidos son polipéptidos modificados en los que la modificación da lugar a una reducción de la propensión del polipéptido a inducir una respuesta inmunitaria tras su administración a una persona. En particular, la invención se refiere a la modificación de anticuerpos reactivos frente al factor de necrosis tumoral humano alfa (TNF alfa) que dan lugar a anticuerpos anti-TNF alfa sustancialmente no inmunogénicos o menos inmunogénicos que cualquier equivalente no modificado cuando se usan in vivo.

Antecedentes de la invención

Existen muchos casos en los que la eficacia de una proteína terapéutica está limitada por una reacción inmunitaria no deseada a dicha proteína terapéutica. Diversos anticuerpos monoclonales de ratón han mostrado ser prometedores como tratamientos en varios contextos patológicos humanos, pero en ciertos casos han fracasado debido a la inducción de grados significativos de respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA, por sus siglas en inglés) [Schroff, R. W. y col. (1985) Cancer Res. 45: 879-885; Shawler, D. L. y col. (1985) J. Immunol. 135: 1530-1535]. En el caso de los anticuerpos monoclonales, se han desarrollado diversas técnicas en un intento por reducir la respuesta HAMA [documentos WOA8909622, EPA0239400, EPA0438310, WOA9106667 y EPA0699755]. Estas técnicas de ADN recombinante generalmente han reducido la información genética del ratón en la construcción final del anticuerpo al tiempo que se aumentaba la información genética humana en dicha construcción final. No obstante, en varios casos, los anticuerpos "humanizados" resultantes han seguido desarrollado una respuesta inmune en pacientes [Issacs J. D. (1990) Sem. Immunol. 2: 449-456; Rebello, P. R. y col. (1999) Transplantation 68:1417-1420].

Los anticuerpos no son la única clase de molécula polipeptídica administrada como agente terapéutico frente a la cual puede desarrollarse una respuesta inmunitaria. Incluso proteínas de origen humano y con las mismas secuencias de aminoácidos que las que aparecen en humanos pueden inducir una respuesta inmunitaria en humanos. Entre los ejemplos destacables se incluye el uso terapéutico del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos [Wadhwa, M. y col. (1999) Clin. Cancer Res. 5: 1353-1361] e interferón alfa 2 [Russo, D. y col. (1996) Bri. J. Haem. 94: 300-305; Stein, R. y col. (1988) New Engl. J. Med. 318: 1409-1413] entre otros.

Un factor clave en la inducción de una respuesta inmunitaria es la presencia en la proteína de péptidos que puedan estimular la actividad de las células T mediante su presentación en el contexto de las moléculas de MHC de clase II, los denominados "epítopes de células T". Estos epítopes de células T se definen normalmente como cualquier secuencia de restos de aminoácidos con capacidad para unirse a moléculas de MHC de clase II. De forma implícita, por "epítope de células T" se entiende un epítope que cuando se une a moléculas de MHC puede ser reconocido por un receptor de la célula T (TCR) y el cual puede, al menos en principio, causar la activación de estas células T acoplándose a un TCR para inducir una respuesta de células T.

Las moléculas de MHC de clase II son un grupo de proteínas muy polimórficas que tienen una función central en la selección y activación de células T colaboradoras. El grupo de antígenos leucocitarios humanos DR (HLA-DR) es el isotipo predominante de este grupo de proteínas, sin embargo, los isotipos HLA-DQ y HLA-DP desempeñan funciones similares. La presente invención es aplicable a la detección de epítopes de células T presentados en el contexto de los antígenos MHC de clase II DR, DP o DQ. En la población humana, los individuos son portadores de dos a cuatro alelos DR, dos alelos DQ y dos DP. Se ha resuelto la estructura de varias moléculas DR y estas aparecen como un surco de unión a péptidos de extremo abierto con varios bolsillos hidrófobos que acoplan restos hidrófobos (restos del bolsillo) del péptido [Brown y col. Nature (1993) 364: 33: Stem y col (1994) Nature 368: 215]. El polimorfismo que identifica los diferentes alotipos de la molécula de clase II contribuye a una amplia diversidad de diferentes superficies de unión para péptidos dentro del surco de unión a péptidos y a nivel poblacional asegura una flexibilidad máxima con respecto a la capacidad para reconocer proteínas extrañas y organizar una respuesta inmunitaria frente a organismos patógenos.

Una respuesta inmunitaria frente a una proteína terapéutica se desarrolla a través de la ruta de presentación del péptido MHC de clase II. Aquí, las proteínas exógenas son engullidas y procesadas para su presentación en asociación con moléculas de MHC de clase II del tipo DR, DQ o DP. Las moléculas de MHC de clase II se expresan en células presentadoras de antígenos (APC) profesionales, como macrófagos y células dendríticas entre otras. El reconocimiento de un complejo MHC de clase II-péptido por un receptor de célula T relacionado en la superficie de la célula T, junto con la unión cruzada de determinados correceptores diferentes, como la molécula CD4, puede inducir un estado activado dentro de la célula T. La activación induce la liberación de citocinas que adicionalmente activan a otros linfocitos, como las células B que producen anticuerpos o activación de células T citotóxicas como una respuesta inmune celular completa.

La identificación del epítope de la célula T es la primera fase de la eliminación del epítope; sin embargo, hay pocos casos claros en la técnica donde la identificación y eliminación del epítope se integren en un único esquema. Por tanto, los documentos WO98/52976 y WO00/34317 muestran técnicas de reconocimiento de plegamiento por ordenador para identificar secuencias de polipéptidos con el potencial para unirse a un subgrupo de alotipos DR de MHC de clase II humano. En estas técnicas se eliminan epítopes de células T predichos mediante el uso de una sustitución razonable de aminoácidos en la proteína de interés. Sin embargo, con este esquema y otros procedimientos por ordenador para la identificación de epítopes [Godkin, A. J. y col. (1998) J. Immunol. 161: 850-858; Sturniolo, T. y col. (1999) Nat. Biotechnol. 17: 555-561], los péptidos predichos como capaces de unirse a moléculas de MHC de clase II pueden no funcionar como epítopes de células T en todas las situaciones, especialmente in vivo, debido a las rutas de procesamiento o a otros fenómenos. Además, las técnicas por ordenador para la predicción de epítopes de células T en general no han sido capaces de predecir epítopes con restricción DP o DQ.

Además de las técnicas por ordenador, existen métodos in vitro para determinar la capacidad de los péptidos sintéticos para unirse a moléculas MHC de clase II. Un ejemplo de método usa líneas de células B de alotipo MHC definido como fuente de unión a la superficie de MHC de clase II y puede aplicarse para la identificación del ligando MHC de clase II [Marshall K. W. y col. (1994) J. Immunol. 152:4946-4956, O'Sullivan y col. (1990) J. Immunol. 145: 1799-1808; Robadey C. y col. (1997) J. Immunol. 159: 3238-3246]. Sin embargo, estas técnicas no están adaptadas para la selección de múltiples epítopes posibles en una amplia variedad de alotipos de MHC, ni pueden confirmar que un péptido de unión pueda funcionar como epítope de células T.

Recientemente se han empleado técnicas que utilizan complejos solubles de moléculas de MHC recombinantes en combinación con péptidos sintéticos [Kern, F. y col. (1998) Nature Medicine 4:975-978; Kwok, W. W. y col. (2001) TRENDS in Immunol. 22:583-588]. Estos reactivos y procedimientos se usan para identificar la presencia de clones de células T a partir de muestras de sangre periférica de humanos o animales de experimentación que son capaces de unirse a complejos MHC-péptido en particular, pero no están adaptados para la selección de múltiples epítopes potenciales en una amplia diversidad de alotipos de MHC.

Los ensayos biológicos de activación de células T siguen siendo la mejor opción práctica para proporcionar una lectura de la capacidad de una secuencia peptídica/proteica problema para inducir una respuesta...

1. Anticuerpo monoclonal modificado anti-TNF alfa derivado del anticuerpo quimérico infliximab que es sustancialmente no inmunogénico o menos inmunogénico en el hombre que el AcMo cA2 (infliximab) cuando se usa in vivo, y que comprende alteraciones de restos aminoacídicos específicos en la región V de sus cadenas ligera y pesada en comparación con el AcMo cA2, en el que dichas alteraciones están en la región V de la cadena pesada:

en el que dichas alteraciones están en la región V de la cadena pesada:

M18L, K19R, V23A, I28T, I51T, I56T, S79N, A80S, V81L, T86N, D87S, R89K, L116V

y en la región V de la cadena ligera:

L3Q, A9D, I10T, L11S, V13A, V19A, Q38H, R39T, I58V, S74T, T77S, V78L, S80A, I83A, D85T;

donde dichas alteraciones causan una reducción o eliminación del número de secuencias peptídicas dentro de dichas regiones V, que actúan en el AcMo cA2 como ligandos de unión a MHC de clase II y estimulan a las células T en el hombre.

2. Anticuerpo modificado de la reivindicación 1, en el que la región V de la cadena pesada alterada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No 3 y la región V de la cadena ligera alterada comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID No 6.

3. Anticuerpo modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que los dominios de la región constante derivan de la IgG1 humana y kappa humana.

4. Anticuerpo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cuando se utiliza como proteína completa en un ensayo biológico de proliferación celular inducida de células T humanas muestra un índice de estimulación menor que el del anticuerpo parental probado en paralelo usando células del mismo donante, en el que dicho índice se toma como el valor de proliferación celular valorado tras la estimulación por la proteína y dividido por el valor de proliferación celular valorado en células control que no reciben la proteína y en el que la proliferación celular se mide por cualquier medio disponible.

5. Molécula de ADN que codifica un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Composición farmacéutica adecuada para el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn que comprende un anticuerpo anti-TNF alfa modificado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, opcionalmente junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables.

7. Uso de un anticuerpo anti-TNF alfa según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la producción de un medicamento para el tratamiento de la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn.